铝胁迫下大豆STOP1同源基因的克隆及功能的初步分析

发布时间：2017-12-14 12:18

  本文关键词：铝胁迫下大豆STOP1同源基因的克隆及功能的初步分析

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【摘要】：酸性土壤约占全世界总耕地面积的30-40%,已成为全球农业发展的限制性因素之一。在酸性土壤(p H≤5.0)中,质子(H+)也会对敏感的植物造成伤害,同时因酸度增加,铝溶解形成Al3+,达到一定浓度时产生毒害,抑制根尖的伸长,从而影响作物对水分和营养的吸收,进而影响作物的产量。C2H2型锌指转录因子STOP1(sensitive to proton 1)和ART1(Al resistance transcription factor 1)在拟南芥和水稻中的分别报道推进了植物抗酸铝的研究,二者均为转录因子,在酸和铝信号转导途径中处于较上游位置,调节了下游一系列抗铝毒或质子毒害的基因,从而在适应低p H和铝毒中起重要作用。在NCBI数据库中,通过BLAST发现大豆基因组共有5个STOP1同源基因,本实验以大豆耐铝品种吉育70和铝敏感品种吉育62作为实验材料,对大豆5个STOP1基因进行功能分析,探讨它们在大豆耐铝中的作用。具体实验内容如下:1.以铝处理4小时的吉育70根尖c DNA为模板,克隆得到5个At STOP1同源的大豆基因,分别命名为Gm STOP1a,Gm STOP1b,Gm STOP1c,Gm STOP1d,Gm STOP1e。5个同源基因编辑的蛋白质均具有C2H2型锌指蛋白的4个锌指保守区域。进化树分析表明Gm STOP1a与At STOP1的同源性较高,其它4个与At STOP2的同源性较高。2.通过实时定量PCR对5个基因进行转录表达水平分析。从时间段实验来看,五个基因均为组成型表达,25μmol Al Cl3处理24小时内表达趋势一致,均为2小时时表达丰度上升,4小时时达到峰值,之后24小时内保持下降趋势,但Gm STOP1a和Gm STOP1e表达丰度高于其他三个。在耐铝品种吉育70和铝敏感品种吉育62中,Gm STOP1a,Gm STOP1c,Gm STOP1d基因在两个品种间差异不大,Gm STOP1b,Gm STOP1e在4小时时在两个品种间转录表达差异较大,且上调水平较高。对土壤生长的大豆植株田间取样后的组织定位研究表明,五个大豆STOP1基因在大豆的各个组织都有表达,在根和荚中表达量较多,利用水培分根段的转录表达研究表明,STOP1在根部的表达主要集中在根尖0-1cm处。对吉育70进行铜、镧、铬等金属胁迫处理表明,除铝外,五个大豆STOP1基因的转录丰度在铜胁迫下也会上调。3.通过Gateway系统构建了35S:STOP1:GFP表达载体,重组载体及空载体转化进入拟南芥原生质体,用共聚焦显微镜观察绿色萤光信号,发现5个基因编码的蛋白均定位于细胞核。将5个STOP1同源基因基因构建到自激活载体p Bridge上,通过在SD-Trp-His培养基上培养,得到5个STOP1同源基因的自激活抑制浓度。综合以上结果分析大豆五个STOP1同源基因可能均具有转录因子的活性。4.将5个基因构建到含有-LUC标签的植物表达载体p EGAD-3XHA-LUC上,将重组的融合表达载体及空载通过农杆菌K599介导转化侵染大豆子叶,获得转化成功的大豆发根;通过农杆菌Agl0介导转化侵染拟南芥,获得T1代转基因种子。五个基因的功能待进一步分析验证。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S565.1;Q943.2

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1 刘荣坤;铝胁迫下大豆STOP1同源基因的克隆及功能的初步分析[D];吉林大学;2016年

2 黄雨涵;利用酵母双杂交系统筛选拟南芥耐铝相关转录因子STOP1互作蛋白[D];吉林大学;2015年

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本文编号：1287868