桦褐孔菌(Inonotus obliquus LNUF008)鲨烯合酶基因工程菌的构建及发酵生产三萜类物质的初步研究
发布时间:2017-12-16 07:18
本文关键词:桦褐孔菌(Inonotus obliquus LNUF008)鲨烯合酶基因工程菌的构建及发酵生产三萜类物质的初步研究
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【摘要】:桦褐孔菌是一种珍贵的药用真菌,早在16世纪,东欧民间就用桦褐孔菌防治肺结核、胃肠癌和心血管类疾病,三萜化合物是桦褐孔菌药用价值的主要活性成分,具有抗氧化、抗肿瘤和抗菌活性,鲨烯合酶(Squalene synthase, SQS)是三萜物质合成途径中的关键酶,其含量和活性决定了三萜化合物的产量。随着野生资源的日益枯竭及对桦褐孔菌需求量的日益增加,应用现代生物技术提高人工培养桦褐孔菌菌丝体三萜类化合物的产量来满足人们对桦褐孔菌的需求尤为重要。本文以本实验室已构建的重组质粒pGAPZaA-SQS为模板,用含有Not Ⅰ和Kpn Ⅰ的引物,通过PCR扩增技术获得了SQS cDNA序列;用含有相同酶切位点的引物,以丝状真菌表达载体pAN7-1为模板,通过PCR扩增技术获得了pAN7-1-△hph基因片段;两片段经T4 DNA连接酶连接,成功构建了重组表达载体pAN7-1-SQS。用溶壁酶(lywallzyme)酶解桦褐孔菌的菌丝膜,成功制备了桦褐孔菌的原生质体,筛选到了适合桦褐孔菌原生质体再生的培养基。pAN7-1-SQS与含潮霉素抗性基因的载体pAN7-1经过线性化后共转化桦褐孔菌原生质体,经原生质体再生及抗生素筛选,成功获得了阳性菌株。以工程菌的基因组为模板,通过设计跨内含子的引物,经PCR扩增技术验证了阳性菌株基因组中存在pAN7-1-SQS上的SQS cDNA序列;同时,以工程菌的基因组为模板,通过设计扩增SQS编码区的引物,通过PCR扩增技术验证了阳性菌株基因组中同时存在SQS基因序列和SQS cDNA序列,胶回收后测序,结果与理论一致,说明pAN7-1-SQS已转入阳性菌株。对桦褐孔菌SQS基因工程菌的三萜化合物的产量及菌丝干重进行初步测定,结果显示,与野生型桦褐孔菌相比,三萜化合物产量提高了34%,而菌丝干重没有明显变化,说明工程菌生长良好。本实验为进一步研究桦褐孔菌药用价值及提高三萜化合物的产量奠定了基础。
【学位授予单位】:辽宁大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:TQ920.1;Q78
【参考文献】
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,本文编号:1295153
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