花生AhbHLH1参与调控FAD2基因在种子中表达的研究

发布时间：2017-12-16 08:18

  本文关键词：花生AhbHLH1参与调控FAD2基因在种子中表达的研究

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【摘要】：bHLH转录因子是植物转录因子中的一个大家族,植物bHLH转录因子不仅在植物正常的生长发育中扮演着重要角色,同时也参与到植物对干旱、盐及冷胁迫等各种胁迫的应答及激素信号传导等过程。实验室前期通过同源克隆方法从花生中克隆到了1个与芝麻SebHLH同源的bHLH类转录因子基因,命名为AhbHLH1。酵母单杂交分析表明,其编码的蛋白可能与花生FAD2基因启动子存在相互作用。对花生FAD2基因调控区序列分析发现,其起始密码ATG上游200bp的调控区存在4个E-BOX元件,-90bp～78bp存在连续2个,-155bp处1个,-42bp处1个。本研究中,利用带有His标签的原核表达系统表达了AhbHLH1蛋白,并通过His-Trap亲和层析柱对蛋白进行了分离纯化。合成了3个生物素标记的包括不同位置E-BOX的双链DNA探针,并通过电泳迁移率检测(Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA)分析了转录因子AhbHLH1与上述3个探针的结合能力；同时构建了用于瞬时表达研究AhbHLH1与FAD2基因体内相互作用的效应载体与报告载体。为进一步研究花生AhbHLH1的功能,构建了AhbHLH1的RNAi载体,并与AhbHLH1过表达载体(实验室前期构建)一起分别对花生进行了遗传转化。通过上述研究,取得了以下三方面主要结果：1. EMSA分析AhbHLH1与AhFAD2基因调控区的结合。将AhbHLH1的5’端加上6个连续的His构建到原核表达载体pLM1中,在大肠杆菌中诱导表达带有His标签的AhbHLH1融合蛋白,并通过His-Trap亲和层析柱分离纯化了目标蛋白。将-90bp～-78bp连续2个E-BOX及其侧翼序列28bp设计为探针P1；-155bp处的E-BOX及其侧翼序列19bp设计为探针P2；-42bp的E-BOX及其侧翼序列19bp设计为探针P3,分别探究AhbHLH1与这三组探针的结合情况。AhbHLH1与探针P1特异结合,与探针P2、P3不结合。初步证明,AhbHLH1通过与AhFAD2基因启动子区域中-90bp～-78bp连续两个E-BOX特异性结合调控其在种子中的表达。2.构建了用于原生质体瞬时表达分析AhbHLH1与AhFAD2调控区体内相互作用的效应载体与报告载体。出发载体pB1121带有CaMV35S全长启动子驱动的GUS表达框架,克隆100bp最小35S启动子,替代CaMV35S全长启动子,构建基本报告载体R0。克隆了与E-BOX元件对应的三段调控区序列I1 (-167bp-24bp)、12 (-148bp-35bp)、I3 (-167bp-55bp),并利用In-Fusion方法分别插入到R0载体最小35S启动子之前,构建了报告载体R1、R2、R3。为后续通过原生质体瞬时表达分析AhbHLH1与目的启动子相互作用做准备。3. AhbHLH1基因过表达与RNAi载体的构建及花生的遗传转化。利用SiRNA在线分析工具,对AhbHLH1基因的ORF区进行SiRNA位点的分析,确定目的干扰片段。构建了AhbHLH1基因的RNAi载体与过表达载体(实验室前期构建)一同进行了花生的遗传转化。经卡那霉素筛选与PCR验证,获得T0代过表达阳性植株3株,T0代INAi植株3株。下一步,我们将通过瞬时表达分析,明确AhbHLH1与目的调控区相互作用；通过分析过表达和RNAi抑制AhbHLH1基因转基因花生中AhFAD2基因的表达状况,以及转基因花生种子储藏脂的脂肪组成,进一步明确AhbHLH1调控AhFAD2基因在储藏脂中不饱和脂肪酸积累过程中的作用。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2

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本文编号：1295327