中红侧沟茧蜂食物链间的传递与定位

发布时间：2016-10-07 15:09

  本文关键词：转基因抗虫水稻MSA和MSB对非靶标害虫褐飞虱和白背飞虱的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

《中国农业科学院》 2007年

Cry1A蛋白在转基因棉花—抗性棉铃虫—中红侧沟茧蜂食物链间的传递与定位

陈洋  

【摘要】： 本文以转cry1A基因棉花(或加入Cry1Ac蛋白的人工饲料)-抗性棉铃虫-中红测沟茧蜂为食物链传递模式，通过ELISA和免疫组织化学技术研究Cry1A蛋白在寄主昆虫及其寄生性天敌昆虫间的运动和积累。同时，研究了Cry1A蛋白对中红侧沟茧蜂的生物学影响及Cry1A蛋白在不同器官中的定位分布及传递，为合理评价转基因植物潜在的生态风险提供依据。主要结果如下： 利用重叠PCR方法扩增得到了约2.5 kb的产物(cry1Ac-GFP融合基因，cry1Ac片断大小为1776 bp，GFP片断大小为714 bp)，构建了pGEX／cry1Ac-GFP原核表达载体，表达了大小约为114kD可以产生绿色荧光的融合蛋白。 棉铃虫取食转cry1Ac基因棉花Nuctn 33B(简称33B)和转GFMcry1A+CDTI棉花sGK321叶片后，棉铃虫的生长发育受到抑制，中红侧沟茧蜂的卵-幼虫历期延长，结茧率降低，成虫寿命缩短。同时，两种转基因棉花处理之间在卵-幼虫历期、茧重、结茧率和成虫体重有显著差异。中红侧沟茧蜂寄生取食Cry1Ac蛋白含量为4ug／g的人工饲料的棉铃虫(简称20.0抗性品系)后，中红侧沟茧蜂的成虫寿命缩短，中红侧沟茧蜂寄生取食Cry1Ac蛋白含量为40ug／g的的人工饲料的棉铃虫(简称高毒饲料品系)后，中红侧沟茧蜂的卵-幼虫历期延长、结茧率下降、茧重减轻、成虫寿命缩短、羽化率降低和成虫体重减轻。 用ELISA方法在取食33B棉花和sGK321棉花叶片的抗性棉铃虫和20.0抗性品系及高毒饲料品系的抗性棉铃虫1～5龄幼虫体内可以检测到微量的Cry1A毒蛋白，大部分的毒蛋白存在于粪便中，被排泄出体外，5龄幼虫的中肠组织和中肠内含物中也有Cry1A毒蛋白被检出。在取食33B棉花叶片和毒饲料的抗性棉铃虫5龄幼虫的血淋巴中检测到微量的Cry1Ac毒蛋白，蛋白含量分别是：鲜重10.52±0.39ng／g和鲜重13.86±1.12ng／g。在寄生取食33B棉花叶片和毒饲料的抗性棉铃虫的中红侧沟茧蜂的老熟幼虫体内检测到微量的Cry1Ac蛋白，蛋白含量分别是：鲜重10.46±0.53ng／g和10.52±0.68ng／g。测定毒饲料处理与常规饲料处理的棉铃虫血淋巴中的可溶性总蛋白含量，结果表明，毒饲料处理的血淋巴中的可溶性总蛋白含量要比常规处理的低。取食转基因棉花叶片处理间的抗性棉铃虫1～5龄幼虫的Cry1Ac毒蛋白占总蛋白的比值变化趋势不同，而20.0抗性品系和高毒饲料品系的1～5龄幼虫体内的Cry1Ac毒蛋白占总蛋白的比值逐渐降低。 从冰冻切片图和免疫定位图片结果可以看出Cry1Ac蛋白在抗性棉铃虫体内的主要结合部位是中肠的刷状缘膜囊(brush border membrane vesicles，简称BBMV)。 以上研究为探索转基因重组蛋白在三级营养食物链间的传递和定位提供了依据，为进一步研究转抗虫基因棉花对昆虫食物链(网)的影响奠定了基础。

【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：S435.622
【目录】：

摘要5-6

Abstract6-11

第一章 文献综述11-21

1.1 引言11

1.2 转基因植物外源DNA和蛋白的环境行为11-13

1.3 转基因植物对非靶标害虫的影响13-15

1.4 转基因植物对捕食性天敌的影响15-17

1.5 转基因植物对寄生性天敌的影响17-18

1.6 转基因植物花粉对其他有益昆虫的影响18-19

1.7 转基因植物对土壤微生物的影响19

1.8 本论文研究的目的及意义19-21

第二章 研究内容和技术路线21-22

2.1 主要研究内容21

2.1.1 CrylA-GFP融合蛋白的原核表达21

2.1.2 转crylA基因棉花/CrylA蛋白对中红侧沟茧蜂的生物学影响21

2.1.3 CrylA蛋白在食物链间的传递与定位21

2.2 研究的技术路线21-22

第三章 转crylA基因棉花/CrylA蛋白对中红侧沟茧蜂的生物学影响22-26

3.1 材料22-23

3.1.1 供试虫源22

3.1.2 供试棉花22-23

3.2 实验方法23

3.3 数据统计分析23

3.4 结果与分析23-25

3.4.1 转基因棉花对中红侧沟茧蜂生物学参数的影响23-24

3.4.2 CrylA蛋白对中红侧沟茧蜂生物学参数的影响24-25

3.5 小结25-26

第四章 crylAc-GFP融合蛋白的原核表达26-38

4.1 材料与试剂26-29

4.1.1 细菌培养基26

4.1.2 菌株与质粒26-27

4.1.3 质粒DNA抽提液27

4.1.4 琼脂糖凝胶电泳缓冲液27

4.1.5 主要试剂27-28

4.1.6 部分储存液配方28-29

4.1.7 仪器设备29

4.2 实验方法29-34

4.2.1 crylAc和GFP的扩增29-31

4.2.2 重叠PCR产物连接到pMD-18载体31

4.2.3 转化31-32

4.2.4 质粒DNA的提取32

4.2.5 检测32-33

4.2.6 原核表达载体pGEX/crylAc-GFP的构建33

4.2.7 crylAc-GFP融合基因在E.coli中的表达33-34

4.2.8 crylAc-GFP融合蛋白鉴定34

4.3 结果与分析34-38

4.3.1 原核表达载体的构建过程及鉴定34-35

4.3.2 融合蛋白SDS-PAGE检测和Western-blot分析35-38

第五章 CrylA蛋白在食物链间的传递与定位38-53

5.1 材料39

5.1.1 供试棉花39

5.1.2 供试棉铃虫和中红侧沟茧蜂39

5.2 试剂与仪器设备39-40

5.2.1 ELISA试剂盒39

5.2.2 主要试剂39-40

5.2.3 主要仪器设备40

5.3 实验方法40-42

5.3.1 样品采集40

5.3.2 ELISA测定CrylA蛋白含量40

5.3.3 可溶性总蛋白含量的测定40-41

5.3.4 免疫定位41-42

5.4 结果与分析42-50

5.4.1 CrylA蛋白含量42-45

5.4.2 可溶性总蛋白含量45-47

5.4.3 CrylA毒蛋白占可溶性总蛋白的比值47-48

5.4.4 CrylA蛋白在抗性棉铃虫体内的定位48-50

5.5 小结50-53

第六章 全文结论与讨论53-56

参考文献56-65

致谢65-66

作者简历66

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