木质素生物合成关键酶基因的研究进展

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第 第 第 分子植物育种， 2007 年， 5 卷， 6(S)期， 45-51 页 Molecular Plant Breeding, 2007, Vol.5, No.6(S), 45-51

专题评述 Invited Review

木质素生物合成关键酶基因的研究进展
李潞滨 1* 刘蕾 2 何聪芬 2 董银卯 2 彭镇华 1<

br />1 中国林业科学研究院林业研究所, 国家林业局林木培育实验室, 北京, 100091; 2 北京工商大学化学与环境工程学院, 植物资源研究开发北京 市重点实验室, 北京, 100037 * 通讯作者, lilubin@126.com

摘

要

占木材干重 15%~35%， 木质素是木材中仅次于纤维素的主要成分， 影响造纸业的造纸工艺和纸张

质量。利用基因工程技术调控木质素生物合成途径中的关键酶基因的表达可以降低木质素含量或者改变木 木质素合成关键 质素成分， 开发新型植物资源， 从源头降低成本， 减少污染。本文介绍了木质素合成的过程， 酶： 苯丙氨酸氨解酶(PAL)， 咖啡酸 /5- 羟基阿魏酸 -O- 甲基转移酶(COMT)， 咖啡酰辅酶 -A-O- 甲基转移酶 (CCoAOMT)， 阿魏酸 -5- 羟基化酶(F5H)， 肉桂酰 CoA 还原酶(CCR)和(肉桂醇脱氢酶) CAD 并统计了在 GenBank 中注册的木质素合成酶关键基因， 论文最后就利用基因工程在改良木质素含量中的应用概况和前 景做了讨论。 关键词 木质素, 生物合成, 关键酶基因

Research Prog resses on the Genes Encoding the Key Enzymes in Biosynthetic Pathway of Lignin
Li Lubin 1* Liu Lei 2 He Congfen 2 Dong Yinmao 2 Peng Zhenhua 1
1 Key Lab of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing, 100091; 2 Beijing Key Lab of Plant Resources Research and Development, College of Chemistry and Environmental Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing, 100037 * Corresponding author, lilubin@126.com

Abstract Lignin, which plays an important role in pulping industry, represents 15%~36% of dry weight of wood and is a major component inferior to cellulose. It might be the way to develop the novel woody resources by reducing the content of lignin or changing the components of lignin based on the genetic engineering approaches that could regulate the expression of the key enzymes in the biosynthesis of lignin, which could decrease the costs and the pollutions from the beginnings of the paper-making industry. The biosynthetic pathways of lignin and the involved enzymes such as PAL, COMT, CCoAOMT, F5H, CCR and CAD were reviewed and the important data about the key enzymes releasing in the GenBank were summarized in this paper. The authors also explored the possibilities of developing the plant with low lignin content by using the genetic engineering approaches, such as RNAi. Keywords Lignin, Biosynthesis, Key genes, Key enzymes 木质素(lignin) 是一种由肉桂醇等单体聚合而成 木 的酚类多聚体是维管植物细胞壁的重要组成成分。 是地球上仅次于纤维素的有机组分 (Zhong et al., 提高细胞 2000)。木质素具有加固细胞壁的机械强度、 运输能力以及抵御病菌微生物侵害的生物学功能 (Guo et al., 2001; Raes et al., 2003; Rogers et al., 2005)。 对用作燃料的木材来说， 高木质素含量的木材能释放 践活动产生一些负面影响， 如木质素含量的牧草会影 木质素是 响草食动物的消化； 而对造纸用木材来说， 影响造纸工艺和纸张质量的主要因素之一。

木质素对人类生产实 一般约占干重 15%~35%， 较多的热量； 但从另一角度看， 材植物中木质素含量较高，

基金项目： 本研究由国家林业局引进国际先进农业科学技术(948)项目(2004-4-26)及(2005-4-37)资助

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分子植物育种 Molecular Plant Breeding

1 木质素研究的意义
在以纸浆为主的木材利用过程中，必须使用大 量的化学药品， 将木材中木质素与纤维素分离。木质 素等成为造纸工业的主要废物，对环境造成严重危 饲 害， 而且化学药品的投入增加了造纸成本。另外， 草植物中木质素的含量还影响牲畜的消化及营养吸 收。因此， 降低木质素含量或改变其组分将有利于更 好地利用植物资源， 有效地保护自然环境(魏建华和 目前还未在任何一种植物中发 宋艳茹, 2001)。此外， 现可降解木质素的酶 (Sederoff et al., 1999)。 目前，主要有两种途径对木质素的降解进行研 究： 首先， 利用酶或者真菌来分解木材纤维材料中的 从而可达到去除 木质素， 可使部分木质素发生降解， 木质素的目的。其次， 在生物化学和分子水平上深入 了解木质素的合成过程，克隆其合成过程中的关键 酶基因，通过基因重组技术对其进行基因操作来改 良木质纤维原料。

S/G 稳定， 含量高， 则木质素结构比较致密。因此， 比 值的降低不利于造纸工业中脱木质素。因此在造纸 木 工业中理想的转基因工程植株木质素含量降低， 质素的 S/G 比值上升。必须将木质素含量降低与组 分改变同时考虑。

3 木质素的合成途径
木质素的生物合成是在一系列酶催化下使苯丙 氨酸或酪氨酸逐步转化为木质素单体，最终聚合成 苯丙烷途径、 木 木质素的过程。此途径包括三部分： 质素合成特异途径和木质素单体糖基化运输及聚合 组成及总木质素含量 为木质素。木质素单体的含量， 随植物种类不同而不同(薛永常等, 2004)。 木质素的合成以苯丙酸起始，经过一系列羟基 化、 甲基化、 连接、 还原反应最终生成上述三种甲基 化程度不同的木质素单体。这些单体经氧化聚合生 对羟基苯基木质素(H)、 成相应的三种木质素： 紫丁 香基木质素(S)和愈创木基木质素(G)。 最后， 这些木 质素在植物体内通过多种键型连接在一起，形成结 构复杂的木质素聚合体(图 1)。

2 木质素的组成
木质素是复杂的苯丙烷单体聚合物， 种主要单 3 松柏醇(coniferyl alco 体为香豆醇(coumaryl alcohol)、 hol)和芥子醇(sinapyl alcohol)。其中松柏醇具有 1 个 C-5 甲氧基基团， 位置可与其他单体形成较稳定的 C-C 连接， 在木质素分离过程中较难除去。而芥子醇 无游离的 C-5， 具有 2 个甲氧基基团，， 使得木质素缺 易除去。 少 C-C 连接而较疏松， 因单体不同， 可将木质素分为 3 种类型： 由紫丁 香基丙烷结构单体聚合而成的紫丁香基木质素(syringyl lignin, S- 木质素)；由愈创木基丙烷结构单体 聚合而成的愈创木基木质素(guaiacyl lignin, G- 木质 素)和由对羟基苯基丙烷结构单体聚合而成的对 - 羟 基苯基木质素(hydroxy_phenyl lignin, H- 木质素) (章 霄云等, 2006)。 植物体木质素含量在 15%~36%之间。裸子植物 双子叶植物主要含愈创 主要为愈创木基木质素(G)； 单子叶植物则为愈创 木基 - 紫丁香基木质素(G-S)； 木基 - 紫丁香基 - 对 - 羟基苯基木质素(G-S-H) (魏 植物体存在多种类型的木质素 建华和宋艳茹, 2001)。 以及多种木质素单体组成，充分表明植物体在进化 和发育上具有不同的适应性或功能特性 (Whetten et al., 1998)。 S 型木质素单体比 G 型木质素单体多一个甲氧 C-C 连接比较 基基团， 多聚体中含少量的 C-C 连接。

4 木质素合成过程中的关键酶及研究进展
近年来，人们利用分子生物学的手段对参与木 质素合成的一些关键酶基因进行了研究，对木质素 合成过程的关键酶进行了克隆，并进一步通过转基 因的实验对这些关键酶对于改变木质素的含量或木 质素的组成及化学结构的影响进行了研究。 4.1 起始反应 4.1.1 苯丙氨酸氨解酶( PAL) 苯 丙 氨 酸 氨 解 酶 (phenylalanine ammonialyas, PAL)的作用下形成反式肉桂酸。是木质素生物合成 途径中的第一个限速酶，其表达及其丰度直接影响 木质素生物合成的整个过程。当 PAL 活性下降时， 植物体中的木质素含量下降 2 倍 (陈建荣等, 2005a; Sewalt et al., 1997)，木质素单体发生变化， 单体含 G 量降低。PAL 的超量表达后木质素的含量明显增加 (Bate et al., 1994; Osakabe et al., 1995)。 抑制 PAL 活性往往伴随着非正常生长或者出 现与次生代谢物质有关的环境适应性和抗逆性下 降。只有 PAL 抑制到一定程度时才影响木质素的合 成， 而且抑制 PAL 的转基因植物木质素含量下降的 同时还伴随着植物体非正常生长。 Sewalt 等(1997)和

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图 1 木质素合成的一般途径(陈永忠等, 2003; Baucher et al., 1998; Li et al., 2000) Figure 1 Biosynthetic pathway of lignin (Chen et al., 2003; Baucher et al., 1998; Li et al., 2000)

Bate 等(1994)得到了抑制烟草 PAL 的转基因植株， 拟南芥 F5H cDNA， 并用 C4H 启动子启动 F5H 的过 使得木质素主要由 S- 木质素组成。同时也不 木质素含量下降但伴随非正常生长，无法应用于实 表达， 仅有人在烟草和杨树上分别过表达拟南芥 F5H 基 际中。 转 因， 也有在拟南芥中过表达杨树 F5H 基因的例子， 4.1.2 肉桂酸 -4- 羟基化酶(C4H) 基因植株的 S- 木质素含量均增加了。由于 S- 木质 PAL 与肉桂酸 -4- 羟基化 酶(cinnamate-4-hy而芥子醇具有 2 个甲氧基基团， 素的单体为芥子醇， 也 droxylas, C4H) 并非特异地参与木质素单体合成， 使得木质素缺少 C-C 连接而较疏松， 无游离的 C-5， 是非木质素酚类物质合成的中间环节。抑制 PAL 与 易除去。因此， F5H 的超量表达是改变林木树种木质 C4H 的转基因植物的木质素含量下降伴随非正常生 素生物合成的一种有效的手段。 这与其在植物次生代谢途径中 长(陈建荣等, 2005a)， 在拟南芥(NM_119790)和油菜(DQ679758B)中 的多功能相符。 分别得到了 F5H 基因的 cDNA 全长。 羟基化反应 4.2 羟基化反应的酶催化的是三种木质素单体之间 的转换，控制羟基化反应的关键酶可以改变木质素 4.2.1 香豆酸 -3- 羟化酶( C3H) 如使 S- 木质素含量升高， 这对于实际的应 的组成， 香豆酸 -3- 羟化酶 (coumarate-3-hydroxyla, C3 用有重要意义。 H)催化香豆酸生成咖啡酸。人们未能从植物中将其 该酶仅有体外 4.3 甲基化反应 分离纯化， 因此对该酶本质不很清楚。 研究， 体内研究证据不足。 4.2.2 阿魏酸 -5- 羟基化酶( F5H) 阿 魏 酸 -5- 羟 基 化 酶 (ferulate-5 -hydroxylas, 先前认 F5H)向来被认为是 S- 木质素合成的控制点， 为是在阿魏酸水平上发挥作用，后来的研究表明 F5H 也在松柏醛和松柏醇水平上起催化作用 (章霄 木质素单体生物合成需经 3' 和 5' 位置的两步甲 基化反应。咖啡酸 /5- 羟基阿魏酸 -O- 甲基转移酶 (caffeicacid-3-O-methyltransferase, COMT)与咖啡酰 辅 酶 -A-O- 甲 基 转 移 酶 (caffeoyl-CoA3-O-methyltransferase, CCoAOMT)是两个不同底物水平上的甲 基化酶。

云等, 2006)。Chapple 等(1992)发现在 F5H 活性缺失 4.3.1 COMT 仅含有微量的 G 木质素。另外， 的拟南芥突变体中， 在大多 COMT 主要参与 S- 木质素的生物合成。 将 F5H 在该突变体中过量表达时，转基因植物中的 数 COMT 抑制的转基因植物中， 木质素含量变化不 木质素基本上都是由 S 木质素组成的。有人克隆了 大， 但也有个别转基因植物在 COMT 活性被抑制到

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足够低时， 木质素含量减少。 在转基因烟草和杨树中， COMT 的下调使木质 对 素组分发生改变， S 型木质素影响较大， 型木质 G 素影响较小， 比值下降(Guo et al., 2001)。Ma 等 S/G (2002) 认为用维管组织特异表达启动子可以调节 COMT 的转录。Atanassova 等(1995)认为 COMT 的 活性被抑制达 80%~90%， 才能对木质素的组分产生 影响。Jouanin 等(2000)在 COMT 活性几乎被全部抑 制(活性残留不足 3%)的转基因杨树才发现木质素的 含量降低。 在 GenBank 中 注 册 的 COMT 基 因 较 多 ， Guillet-Claude 等(2004)人克隆了 33 种不同杂交品种的 玉 米 的 COMT 基 因 ， 获 得 了 部 分 或 全 长 cDNA (AY323272-AY323305)。 4.3.2 CCOAOMT CCoAOMT 在植物中是与木质素合成有关的较 对 原始的酶类， G 木质素合成特异调控。 近年来， 利用反义 RNA 技术转化植物得到了木 质素含量和化学组分改变的植物，涉及的植物包括 杨树， 火炬松等(章霄云等, 拟南芥， 烟草， 百日草， 2006)。Meyermans 等(2000)在抑制 CCoAOMT 表达 的转基因杨树中发现木质素的含量降低了 12%。 Zhong 等(1998)获得了反义 CCoAOMT 表达的转基 因烟草， 木质素的含量下降了 36%~37%。利用反义 当毛 CCoA OMT 基因可培育低木质素含量的毛白杨， 白杨中 CCoAOMT 活性受到抑制时，能有效地降低 植物中木质素含量，对植物的生长和发育及其内部 机械输导系统未产生明显的负效应。 Sewalt 等(1997) 苜蓿的 CCoAOMT 被抑制后， 发现烟草， 其木质素含 量相应的降低，当 CCoAOMT 的活性几乎被完全抑 苜蓿 G 木质素的含量下降了 50%， 制时， 但对 S 型 木质素没有影响。另外，陈建荣等 (2005b; 2006a; 2006b) 对 CCoA OMT 基因反义表达载体的构建及转 化苎麻，并克隆了苎麻 CCoA OMT 基因的全长 cDNA， 但其对苎麻木质素含量的影响效果还在进一步 的研究中。 此酶表达受到抑制后，转基因植物木质素含量 且 其中后者减少显 下降， S 和 G 木质素含量都减少， 木质 著， 从而导致 S/G 比值升高。而 S/G 比值增加， 素结构疏松利于脱去， 因此具理想的应用前景。 和章霄云等(2006)对苎麻的 CCOA OMT 基因进行了 许多人对 CCOA OMT 进行了研究： Guo 等(2001)

CCOA OMT 基因的启动子序列(AF098159)。 获得了许多物 目前， 对于甲基化酶的研究较多， 种的木质素合成酶中的催化甲基化反应的关键酶， 有 转基因研究表明， 在不同的植物中效果不尽相同： 些直接影响木质素的含量，而有些影响木质素的结 对于甲基化酶 构及组成。然而， 大量研究结果表明， 的抑制可以有效的降低木质素的含量或改变木质素 因此具有较高 的组成， 而又不影响植物的生长发育， 甲基化酶在 的利用价值。另外， 一些研究结果表明， 一些植物体内是以基因家族的形式出现，这对于甲 基化酶的调控带来了困难。因为基因家族中不同基 因可能参与植物体内不同的生理代谢过程。 4.4 连接反应 4.4.1 4- 香豆酸辅酶 A 连接酶(4CL) 肉 桂 酸 在 4 - 香 豆 酸 辅 酶 A 连 接 酶 (cinna实 mate-4-hydroxylae, 4CL)作用下生成相应 CoA 酯， 转基因植物研究表 际是对将被还原的基团进行活化， 抑制 4CL 的转基 明， 不同植物的 4CL 功能不尽相同。 表明该酶在木质素 因植物的木质素含量均明显下降， 单体合成途径中为限速步骤，但其具体功能尚需研 究。 目前， 4CL 基 因 在 白 皮 松 (DQ018377)、 玉 米 (AY566301)、 大 麻 槿 (DQ840569) 和 欧 洲 云 杉 (AM265585)。扁叶松(DQ018378)中获得了 4CL 基因 的部分或全部 cDNA 序列。在金鱼草(Y15607)中获 扁叶松中获得了外显子 得了启动子序列， 在白皮松、 序列。 4.5 还原反应 4.5.1 肉桂酰 CoA 还原酶( CCR) 肉 桂 酰 CoA 还 原 酶 (cinnamoyl-CoA reductas, 生成相应肉 CCR)可还原 3 种羟基肉桂酸的 CoA 酯， 桂醛。该反应被认为是潜在的碳向木质素分配的控 制关节点。目前， CCR 基因在 GenBank 中注册的有： 拟 南 芥 (AF320624)、 桉 树 (X79566)， 大 麻 槿 (EF031545)、 欧洲云杉(AM260972)和甘蔗(AJ231134) 的 CCR 部分或全部 cDNA 序列。在胶杨(AJ295838) 和蓝桉树 (AJ231134)中获得了外显子序列。 一些研究表明，抑制该酶表达，木质素含量降 但这些物质并 低， 同时一些非正常的酚类物质增加， 不参与木质素的聚合过程。利用反义核酸技术能够 但影响植株的生长发育(Li et 抑制 70%的 CCR 活性， al., 2001)。

研究， 获得了不同杂交品种苎麻的 CCOA OMT， 并在 GenBank 中进行了注册。 等(2000)还获得火炬松中 Li

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4.5.2 肉桂醇脱氢酶( CAD) 肉桂醇脱氢酶 (cinnamoyl alcohol dehydrogenas, 即肉桂 CAD)催化木质素前体生物合成的最后一步， 醛还原为肉桂醇。 蓝桉 (AF038561)、柳叶桉 (AF294793)、草莓 (U63534)、 黑麦草(AJ585090)、 紫花苜蓿(Z19573)、 Hi原 帝国杨(Z19568)、 欧洲 biscus cannabinus (DQ675603)、 云 杉 (AJ868574)、 美 洲 山 杨 (AF217957)、 甘 蔗 (AJ231135)和 Schedonorus arundinaceus (AJ585034)等 植物的 CAD 基因部分或全长 cDNA 已被在 GenBank 进行了注册。 CAD 催化木质素单体合成最后一步， 在几种植 物体内 CAD 活性被抑制以后， 木质素总量并没有明 显改变。Halpin 等(1994)报道在抑制 CAD 活性的转 CAD 活性为正常水平的 10%，然而并 基因烟草中， 没有改变烟草的发育及细胞中木质素的总量。抑制 CAD 的活性， 木质素中出现了一种新的组分—— —肉 苜蓿木质 桂醛， 因为木质素分子中 S 残基含量降低，

径中同一个酶的不同基因可能因代谢分隔而表达方 式不同，特异性地参与不同产物或同一产物不同时 其他 期的生物合成。可能在某个酶的基因被抑制后， 相关酶可对其进行补偿且产生特殊木质素单体。

6 对植物木质素的研究展望

其 目前， 除对极少的木质素建立了结构模型外， 他很多木质素空间结构和代谢途径还不完全清楚。 印度是竹造纸最多的国家，但对木质素的研究少有 对竹木质 报道。国外对竹木质素研究较多的是日本， 素的理化性质研究的较深入。目前国内对于竹木质 素的研究较少。 参与木质素合成的酶有许多，抑制不同的酶对 现在主要是提取 RNA， 于木质素会获得不同的结果。 并 再利用 RT-PCR 获得 cDNA，随后构建表达载体， 使用农杆菌导入植物体内进行表达，最后进行木质 素含量的测定。以上为常用的对于木质素合成酶基 因的研究方法。目前， 人们发现在生物体内普遍存在 素的 S/G 比率下降(Chabanes et al., 2001)。 反义 CAD 一种保守的基因转录后沉默机制(post-transcriptional 转基因烟草、苜蓿与杨树的木质素含量也未明显降 gensilencing, PTGS)。这种 PTGS 可由外源或内源的 低 (Baucher et al., 1996; 1999; Higuchit et al., 1994)， 双链 RNA (double stranded RNA, dsRNA) 降解为 仅特殊组份—— —松柏醛(coniferylaldehyde)明显增加 21~25 碱基的干扰性 RNA (small interference RNA, (耿飒等, 2003)。 目前转基因研究表明 CAD 活性被强 siRNA)， 从而引发生物体细胞内同源 mRNA 的特异 烈抑制，植物体仍可维持正常木质素水平可能是抑 性降解，这种 PTGS 称为 RNA 干扰 (RNA interfer制程度还不足亦或存在其他酶的补偿作用，其原因 ence, RNAi) (Hannon, 2002; Matzke et al., 2001)。 有待深入研究。 RNA 干扰有相当的高效性，是反义 RNA 表达技术 可以通过 RNA 对基因抑制效率的 10 倍左右。因此， 4.6 木质素单体的聚合 干扰技术对竹类植物的木质素合成关键酶基因进行 木质素单体合成以后，需要脱氢聚合才能形成 研究， 也许可以取得更好的效果。 木质素。 最初证明漆酶在有氧的条件下能够产生木质 参考文献 素， 以后又发现过氧化物酶(POD)也可有效地催化该 Atan a ssova R., Favet N., Martz F., Chabbert B., Tollier M.T., 聚合反应，在一些植物中几种参与木质素合成反应 Monties B., Fritig B., and Legrand M., 1995, Alter lignin 的过氧化物酶同工酶已分离出来。 composition in transgenic tobacoo expressing o-methyltrans综上所述，运用现代生物技术控制木质素含量 ferase sequence in sense and antisense orientation, Plant J., 或改变其组成目前还处于探索阶段。若以不影响植 8(4): 465-477 提高 S/G 比值及 Bate N.J., Orr J., Ni W., Meromi A., Nadler-Hassar T., Doerner 物生长为前提， 以降低木质素含量、 P.W., Dixon R.A., Lamb C.J., and Elkind Y., 1994, Quanti制浆效率等为目标衡量转基因植物是否适合用于造 tative relationship between phenylalanine ammonia lyase 则 纸， 4CL、 CCoA OMT 和 F5H 是较为理想的用于造 level and phenylpropanoi d accumulation in transgenic to纸原料植物品质改良的目标基因。

5 木质素单体合成途径的多样性
植物体中参与木质素生物合成的酶存在多基因 木质素单体合成途 现象， 即以基因家族的形式出现。

bacco identifies a rate determining step in natural product synthesis, Proc Natl Acad Sci USA, 91: 7608-7612 Baucher M., Andree M., Vailhe B., Chabbert B., Besle J.M., Opsomer C., van Montaqu M., and Botterman J., 1999, Down-regulation of cinnanyl alcohol dehydrogenase in trans-

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  本文关键词：木质素生物合成关键酶基因的研究进展，由笔耕文化传播整理发布。