人源化基因修饰猪内皮细胞的分离培养及鉴定

发布时间：2017-12-25 09:28

  本文关键词：人源化基因修饰猪内皮细胞的分离培养及鉴定　出处：《西北民族大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 小型猪 异种移植 主动脉内皮细胞 肝窦内皮细胞 CD31

【摘要】：异种移植(Xenotransplantation)是解决临床器官供体短缺的重要途径之一,猪被认为是人类异种器官移植的理想供体。然而,猪器官应用于人类器官移植方面却面临着多种排斥反应。将猪的α-1,3半乳糖基转移酶基因(0α-1,3GT)敲除及转人补体调节蛋白CD46能基本克服超急性排斥,但是仍然存在急性血管排斥反应和凝血紊乱等问题,其中血管内皮细胞的损伤是介导放大免疫排斥反应及凝血功能紊乱的重要环节。在猪到狒狒的肝移植中发现,受体在术后出现严重的血小板减少性内出血,初步发现血小板的减少与肝脏中肝窦内皮细胞的吞噬有关。本研究分离培养了猪主动脉内皮细胞(Porcine arterial endothelial cell, pAEC)和猪肝窦内皮细胞(Porcine liver sinusoidal endothelial cell, pLSEC)建立了猪肝窦内皮细胞分离纯化的方法,为在体外研究异种移植免疫排斥奠定了基础。利用课题组创建GGTA1、ASGR1、CMAH基因敲除的和转入hCD46、hTBM基因的异种移植小型猪,分离培养pAEC和pLSEC,并对GGTA1、ASGR1、 CMAH、hCD46在内皮细胞的表达进行流式分析。利用FITC-CD31流式细胞分析pAEC和pLSEC的纯度,扫描电镜和透射电镜观察pLSEC窗孔结构,免疫荧光法检测pAEC、pLSEC摄取DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)的内吞功能,实时荧光定量PCR (Real-time PCR, qRT-PCR)检测pLSEC、pAEC、猪耳成纤维细胞(Porcine ear fibroblast cell, pEFC)的CD31、CD146、Ⅷ因子、vWF因子的表达。采用端粒酶的逆转录的酶(Telomerase reverse transcripatase of human, hTERT)对pAEC进行永生化。流式细胞术对多基因修饰猪的相关基因GGTA1、ASGR1、CMAH、hCD46在内皮细胞上的表达进行分析。研究结果如下：(1)分离培养的pAEC呈典型的内皮细胞形态,铺路石样排列,生长状态良好；pAEC吸收Dil-Ac-LDL,流式细胞术结果表明培养第3代的pAEC表达CD31的纯度高达99.8%。(2)利用CD31作为肝窦内皮细胞的特异性标记来分离猪肝窦内皮细胞,得到的pLSEC呈内皮细胞的典型形态,铺路石样排列,具有标志性的窗孔结构；pLSEC具有DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-Ac-LDL)的内吞功能；培养第3代的pLSEC表达CD31高达96.3%,说明pLSEC传代培养的稳定性高、纯度达96.3%。pLSEC表达肝窦内皮细胞的特异性标记分子CD146、Ⅷ因子、vWF, pLSEC表达CD31、CD 146、Ⅷ因子、vWF表达量显著高于pAEC和猪耳成纤维细胞(Porcine ear fibroblast cell, pEFC)。(3)质粒pCI-neo-hTERT电转染pAEC后,细胞已传代至第14代,pAEC永生化后保持了正常的血管内皮的生物学特性。(4)通过流式细胞术对GGTA1、ASGR1、CMAH基因敲除和转入hCD46基因的用于异种移植的小型猪基因在内皮细胞的表达进行分析,表明多基因修饰猪的无GGTA1、ASGR1、CMAH基因相关蛋白的表达,hCD46基因修饰猪表达hCD46蛋白。总之,本研究成功建立了多种基因修饰猪的主动脉内皮细胞和肝窦内皮细胞,利用CD31来纯化pAEC,同时转入pCI-neo-hTERT,得到永生化的pAECo确定了CD31可作为分离纯化pLSEC的特异性标记分子。pAEC和pLSEC为研究非Gal抗原以及肝窦内皮细胞对血小板吞噬的问题提供了良好的细胞模型。利用流式细胞分析的方法对多基因修饰猪的GGTA1、ASGR1、CMAH基因敲除和hCD46基因转入进行检测,提供了一种快速、准确的鉴定多基因修饰猪的方法。
【学位授予单位】：西北民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q813.11

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本文编号：1332285