日本沼虾酚氧化酶原激活因子基因克隆及其表达分析

发布时间：2018-01-01 07:27

  本文关键词：日本沼虾酚氧化酶原激活因子基因克隆及其表达分析　出处：《山东农业大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：日本沼虾(Macrobrachium nipponense),俗称青虾,属于甲壳纲(Crustarcea)、十足目(Decaplda)、长臂虾科(Palaemonidae)、沼虾属(Palaemonidae),广泛分布于我国多种淡水水域,是我国淡水虾类养殖中一个重要的养殖品种。近年来,青虾养殖中的病害问题日益凸显,成为制约青虾养殖业健康发展的重要因素,亟待研究和解决。酚氧化酶原激活系统(Prophenoloxidaseactivating system,pro-PO)是无脊椎动物先天免疫机制中最重要的组成部分。酚氧化酶原激活因子(prophenoloxidase-activating Factor,PPAF)是酚氧化物酶原激活及其辅因子丝氨酸同系物活化的重要因子,可以直接影响酚氧化酶的活力和机体的免疫防御机制。这些免疫相关因子在抵御病原微生物入侵,以及参与机体免疫活动,一直倍受关注。本研究通过RACE方法首次克隆了日本沼虾PPAF的cDNA全长序列;通过半定量PCR技术分别对目的基因进行了不同组织的表达谱分析,主要研究内容和结果如下。通过RACE技术首次得到PPAF基因的cDNA全序列,全长1261bp,包括364bp的5'UTR,822bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),75bp的3'UTR。编码区271个氨基酸,预测蛋白质分子量是30.389.86kDa,等电点为9.727,其中包含34个碱性氨基酸(K,R),18个酸性氨基酸(D,E),94个疏水性氨基酸(A,I,L,F,W,V),75个极性氨基酸(N,C,Q,S,T,Y)。开放阅读框的组成分析结果发现其G、C碱基的含量(51.09%)高于A、T碱基的含量(48.91%)。分析日本沼虾PPAF基因的氨基酸序列的结构域,结果发现在84-277区域左右有一个胰蛋白酶功能域,在77-278区域中有一胰蛋白酶家族中的类丝氨酸蛋白功能域。构建了进化树,分析表明日本沼虾PPAF基因与中国对虾的同源性最高,与家蚕、棉铃虫的同源性最低。采用荧光定量PCR技术检测了PPAF基因在沼虾体内不同组织的差异表达情况。检测结果显示,PPAF基因在健康的日本沼虾的不同组织内表达水平差异显著(P0.05),在肝胰腺、鳃和血细胞等免疫相关的组织中的表达水平较高;而在肌肉、精巢、卵巢和甲壳等组织中的表达水平低。选取肝胰腺组织来检测PPAF基因在沼虾感染嗜水气单胞菌后不同时期的表达量变化情况,以空白组的β-actin基因作标准,检测不同时期表达量变化规律。半定量PCR分析结果发现,在感染了嗜水气单孢菌后的72h内,日本沼虾的PPAF基因在肝胰腺、鳃、血细胞组织中的mRNA表达差异显著(P0.05)。PO活性在攻毒组中变化明显,在嗜水气单胞菌刺激后,PO活性在注射3小时后增加到4.23倍,与生理盐水注射组相比有显著的提高。嗜水气单胞菌注射后的PO活性的显著变化现象表明,细菌可以触发酚氧化酶原激活系统转换成PO,说明青虾的酚氧化酶原系统可以抵御外界细菌的侵袭,表明酚氧化酶原系统在青虾的免疫系统中起到着重要的作用。PPAF是日本沼虾最重要的体液免疫系统proPO的关键性因子,在机体的免疫系统中占有重要地位。本研究对PPAF基因在感染嗜水气单胞菌后免疫组织中的表达规律的研究,揭示了日本沼虾在对抗细菌性疾病的免疫防御中的遗传机制奠定了基础;进一步揭示了酚氧化酶原激活系统参与免疫防御的遗传机制奠定了基础。
[Abstract]:M.nipponense (Macrobrachium nipponense), commonly known as shrimp, belongs to Crustacea, Decapoda (Crustarcea) (Decaplda), Palaemonidae (Palaemonidae), Macrobrachium (Palaemonidae), is widely distributed in our country in a variety of fresh water, is one of the most important aquaculture species of Chinese freshwater shrimp aquaculture. In recent years, the disease of shrimp farming has become increasingly prominent, has become an important factor restricting the healthy development of shrimp aquaculture, need to be studied and solved. The prophenoloxidase activating system (Prophenoloxidaseactivating system pro-PO) is the most important part of invertebrate innate immune mechanisms in the matter. The prophenoloxidase activating factor (prophenoloxidase-activating, Factor, PPAF) is a phenolic oxide and its zymogen activation an auxiliary factor activated serine homologues, can directly affect the immune defense mechanism of phenol oxidase activity and the body's immune phase. These 鍏冲洜瀛愬湪鎶靛尽鐥呭師寰�鐢熺墿鍏ヤ荆�

本文编号：1363516