Ⅱ基因转基因水稻快速检测技术的建立

  本文关键词：带npt-Ⅱ基因转基因水稻快速检测技术的建立，由笔耕文化传播整理发布。

以转溶菌酶基因水稻纯系材料中花9号(ZH9(R))及其受体品种中花9号(ZH9(CK))为材料, 以ZH9(R)中携带的npt-Ⅱ基因作为辅助筛选标记, 利用抗生素对其进行处理, 建立了一套快速检测带npt-Ⅱ基因转基因水稻的技术体系。使用不同浓度的卡那霉素(Kanamycin, Kan)和G418溶液将ZH9(R)和Z

504 HEREDITAS (Beijing) 2007

第29卷

表5 水稻幼苗对G418敏感性的测定结果

Table 5 Sensivity result of G418 testing young seedlings of ZH9(R) and ZH9 (CK)

4天 (4 day) 8天 (8 day) 12天 (12 day) G418

(mg/L) ZH9(R) ZH9(CK) ZH9(R) ZH9(CK) ZH9(R) ZH9(CK)

0 100 150 200 250 整株枯死。

+++ +++

60, 跟80 mg/L G418条件下的检测结果完全一致, 适合大田中成株离体叶片的快速检测; 在验证种子快速检测方法中, 发现PCR呈阳性的种子有60粒, 占整个存活种子的92.31%, 适合大批量种子的快速检测; 在验证幼胚快速检测方法中, 发现PCR呈阳性的幼胚有60颗, 占整个存活幼胚的89.55%, 适合室内幼胚的快速检测; 在验证幼苗快速检测方法中, 发现PCR呈阳性的幼苗也是60株, 占整个存活幼苗的96.77%, 适合室内组培苗的快速检测。

2.7 应用G418快速检测ZH9(R)转育后代群体结

果分析

+ +

++ ++

+ + +++ ++ ++++

: 无变化; +: 叶尖开始卷曲; ++: 叶面开始变黄; +++: 整株黄化; ++++:

: Shows no variation; +: Shows needles begin to curl; ++: Show

leaves are yellow; +++: Show the plants are yellow; ++++: Shows plants are dead.

临界浓度。 2.6 PCR检测结果

将G418(溶液或培养基)筛选获得的ZH9(R)和ZH9(CK)混合群体阳性叶片对应的植株叶片60份、种子萌芽筛选后的存活苗65株、幼胚萌芽筛选后的存活苗67株和幼苗筛选后的62株分别提取的DNA进行了PCR扩增(表6、图1), 结果表明, 已扩增出了与npt-Ⅱ基因的和溶菌酶基因序列长度完全一致DNA特征带, 且二者结果完全相符, 这说明npt-Ⅱ基因和溶菌酶基因是紧密连锁遗传的。

在验证叶片快速检测方法中, 通过对60株成株所提DNA的PCR检测结果分析, 发现阳性株数为

2.7.1 应用G418快速检测ZH9(R)转育回交后代

群体叶片

应用本研究建立的npt-Ⅱ标记基因叶片快速检测方法用80 mg/L浓度的G418溶液对9311/ZH9(R)、MH63/ZH9(R)、PA64s/ZH9(R)、288/ZH9(R)、E32/ ZH9(R)的BC1F1代和9311/ZH9(R)、MH63 /ZH9(R)、PA64s/ZH9(R)的BC2F1代群体叶片进行单株抗性鉴定, 4天后, 效果非常明显, 经χ2测验, 回交后代抗性株与敏感株的分离比约为1︰1(表7)。

2.7.2 应用G418快速检测ZH9(R)转育回交后代 和回交自交后代群体种子

应用种子快速检测方法用300 mg/L G418溶液筛选9311/ZH9(R)和MH63/ZH9(R)的BC3F1代群体

表6 npt-Ⅱ基因和溶菌酶基因的PCR扩增结果

Table 6 PCR amplification result of npt-Ⅱand lysozyme gene

PCR检测结果 PCR result

npt-Ⅱgene Lysozyme gene

阳性 Positive 阴性Negative 阳性Positive 阴性Negative

叶片检测数 No. of the tested

leaves

种子检测数 No. of the tested

seeds

幼胚检测数 No. of the tested young embryos

幼苗检测数 No. of the tested young seedlings

60 60 60 60 60 60

60 60

0 5 7 2

0 5 7 2

图1 PCR扩增结果

1~11: npt-Ⅱ基因扩增; 12~22: 溶菌酶基因扩增。1、22: 质粒; 2~11: ZH9(R); 12~21: ZH9(CK)。

Fig. 1 PCR amplification results

1-11: npt-Ⅱgene, 12-22: Lysozyme gene.1,22: Plasmid; 2-11: ZH9(R); 12-21: ZH9(CK).

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