人HCN4基因真核表达质粒构建及在HEK293细胞中的表达

发布时间：2018-01-16 00:14

本文关键词：人HCN4基因真核表达质粒构建及在HEK293细胞中的表达　出处：《皖南医学院学报》2016年06期 　论文类型：期刊论文

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【摘要】：目的:构建人HCN4基因的真核表达质粒并转染人胚胎肾细胞,建立异源性表达HCN4通道模型。方法:通过聚合酶链反应扩增人HCN4基因全长核苷酸序列,双酶切(Xho I和EcoRI)后插入真核表达质粒p IRES2-EGFP中,构建重组真核表达质粒p IRES2-HCN4-EGFP。应用脂质体法将重组质粒p IRES2-HCN4-EGFP转染入HEK293细胞中进行表达。全细胞膜片钳技术检测HCN4通道电流。结果:酶切及测序的结果显示p IRES2-HCN4-EGFP构建成功,倒置荧光显微镜能观察到EGFP绿色荧光,反转录-聚合酶链反应检测到HCN4 mRNA表达,膜片钳检测到HCN4基因编码的通道电流。结论:成功建立异源性表达HCN4通道模型,为进一步研究HCN4通道电生理特性提供了实验基础。
[Abstract]:Objective: to construct the eukaryotic expression plasmid of human HCN4 gene and transfect it into human embryonic kidney cells. Methods: the full-length nucleotide sequence of human HCN4 gene was amplified by polymerase chain reaction. Xho I and EcoRI) were digested and inserted into eukaryotic expression plasmid p IRES2-EGFP. Construction of recombinant eukaryotic expression plasmid pIRES2-HCN4-EGFP.The recombinant plasmid pIRES2-HCN4-EGFPwas constructed by liposome method. IRES2-HCN4-EGFP was transfected into HEK293 cells for expression. Whole cell patch-clamp technique was used to detect the current of HCN4 channel. Results: the results of enzyme digestion and sequencing showed that p. IRES2-HCN4-EGFP was successfully built. EGFP green fluorescence was observed by inverted fluorescence microscope and HCN4 mRNA expression was detected by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Conclusion: the heterogenous expression HCN4 channel model was successfully established, which provides an experimental basis for the further study of the electrophysiological characteristics of HCN4 channel.
【作者单位】：皖南医学院第一附属医院弋矶山医院心内科;皖南医学院活性生物大分子研究安徽省重点实验室;南京医科大学附属南京医院心内科;
【基金】：安徽高校省级自然科学研究项目(KJ2013Z340;KJ2016A728) 活性生物大分子研究安徽省重点实验室自主研究课题(LAB201403,LAB201401) 安徽省大学生创新训练计划项目(AH201410368150)
【分类号】：R54
【正文快照】： 正常心脏节律的产生取决于起搏细胞4相自动除极化,而If电流在此除极化过程中起着重要作用[1]。If电流由超极化激活的环核苷酸门控通道(HCN通道)开放产生,该通道由HCN基因编码,其电生理特性是超极化时被激活,呈电压和时间依赖性,为非选择性的内向阳离子通道[2]。目前已知HCN基

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