猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆的构建及S基因突变对弱毒株体外增殖和致病性的影响

发布时间：2018-01-19 11:34

本文关键词： 猪流行性腹泻病毒感染性cDNA克隆病毒拯救 S基因突变增殖致病性　出处：《中国农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以急性肠炎、腹泻、呕吐、脱水为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。各年龄段猪对该病均易感,其中哺乳仔猪的发病率和死亡率最高,可达100%。2010年以来,我国出现以S基因变异为主要特征的高毒力PEDV变异毒株并广泛流行,引起PED疫情的暴发,给养猪业造成了巨大的经济损失。因此,开展PEDV的致病机制研究对于PED的防控具有重要的科学意义。本研究以PEDV分离毒株为研究对象,构建PEDV反向遗传操作技术平台,并进一步分析S基因突变对PEDV的增殖和致病性的影响,以期为阐明PEDV的分子致病机制奠定必要的技术基础。从北京地区发生仔猪腹泻的猪场临床病料中分离到1株PEDV,命名为CHM2013。CHM2013具有良好的细胞适应性,可以在Vero细胞上稳定传代,其增殖无需在培养基中添加胰酶。根据GenBank中收录的PEDV基因组序列设计引物,采用RT-PCR的方法扩增PEDV CHM2013基因组片段,并进行全基因组序列测定。结果显示,排除poly(A)尾,CHM2013的全基因组大小为27994 nt。选取26株分属不同亚群具有代表性的PEDV毒株的全基因组序列与CHM2013进行比较并绘制进化树。结果表明,CHM2013属于PEDV的GⅠ亚群,与经典毒株CV777、SM98、DR13属同一亚群,全基因组同源性为97.9%-99.9%;与GⅡ亚群的参考毒株相比,同源性为96.5%-96.8%,而与重组毒株的同源性为97.0%-97.1%。基于PEDV毒株CHM2013和实验室分离的强毒株BJ-2011-C的全基因组序列设计引物,分段进行RT-PCR扩增,并通过同义突变引入酶切位点,将CHM2013及BJ-2011-C的全长cDNA连入低拷贝质粒pBeloBAC11,同时插入巨细胞病毒启动子(CMV)、丁型肝炎核酶序列(HDV-RZ)、牛生长激素序列(BGH)等元件,获得PEDV CHM2013和BJ-2011-C的全长cDNA克隆质粒pBAC-CHM2013和pBAC-B J-2011-C。采用点突变方法对CHM2013基因组的1809位碱基(T-→C)、BJ-2011-C基因组的15932位碱基(G→A)进行突变,引入遗传标记以区分拯救病毒与亲本病毒。将全长cDNA克隆质粒直接转染Vero-CCB81细胞,观察细胞病变并鉴定拯救病毒。结果表明,转染的Vero-CCB81细胞能产生与亲本病毒感染相同的细胞病变;提取P3代拯救病毒基因组进行RT-PCR检测及序列测定,可以检测到遗传标记的存在;用PEDV N蛋白单抗4E3进行间接免疫荧光试验,可见拯救病毒感染细胞呈现特异性荧光染色。拯救的克隆病毒分别命名为rCHM2013和rBJ-2011-C。由此表明,构建的PEDV毒株CHM2013和BJ-2011-C的全长cDNA克隆具有感染性,可成功拯救出病毒。分析了拯救病毒的体外增殖特性和对哺乳仔猪的致病性。多步生长曲线试验结果表明,rCHM2013和rBJ-2011-C在Vero-CCL81细胞上具有与其亲本病毒相似的培养特性和增殖动态。动物致病性试验结果显示,rBJ-2011-C呈现高毒力,接种的2日龄哺乳仔猪出现严重腹泻,死亡率为100%(4/4);而rCHM2013接种仔猪全部存活,未见腹泻的临床症状,表明PEDVCHM2013是弱毒株。利用弱毒株CHM2013的感染性cDNA克隆,依据PEDV强毒株S基因变异的特点,选择其中五个变异较大的区域(aa27-29QST→SAN;aa56-58MNS→GENQGVN氨基酸插入及突变;aa68-72 GTGIE→AGQHP;aa84-89 YIDSSQ→HIRGGH;aa158-163 RDGKDI→SEHS氨基酸缺失及突变),构建出以CHM2013为骨架单独置换各个区域的cDNA克隆质粒,并进行病毒拯救。结果显示,R-C-GENQGVN和R-C-SEHS两个重组cDNA克隆具有感染性,可拯救出病毒;而其余三个重组cDNA克隆无感染性,不能拯救出病毒。我们进一步构建了同时置换GENQGVN和SEHS两个区域的重组克隆R-C-GENQGVN+SEHS,并拯救出重组病毒。对拯救的重组病毒增殖动态分析结果表明,拯救出的三个突变体重组病毒在Vero细胞上的增殖动态与rCHM2013相似。致病性试验结果显示,R-C-GENQGVN+SEHS对仔猪无明显的致病性,接种仔猪无腹泻临床症状,表明依据PEDV强毒株S基因的变异特点,进行弱毒株CHM2013的S基因插入及缺失突变,不会导致弱毒株致病性增强。综上所述,我们成功构建了 PEDV弱毒株CHM2013和强毒株BJ-2011-C的感染性cDNA克隆,并初步分析了 PEDV强毒株S基因插入及缺失对弱毒株CHM2013复制能力和致病性的影响。结果表明,构建的PEDV弱毒株和强毒株的cDNA克隆具有感染性,可拯救出病毒;PEDV强毒株S蛋白标志性的氨基酸插入及缺失不影响弱毒株的体外增殖能力和致病性,为进一步深入研究PEDV的分子致病机制奠定了必要的反向遗传操作技术平台。
[Abstract]:A high virulent PEDV strain named CHM2013.CHM2013 was amplified by RT - PCR . The results showed that the whole genome sequence of PEDV was 97.0 % - 97.1 % . The results showed that the recombinant cDNA clone of CHM2013 and BJ - 2011 - C was infected with the virus . The results showed that the recombinant clones of CHM2013 and rBJ - 2011 - C were infected with the same virus . The results showed that the recombinant clones of CHM2013 and BJ - 2011 - C were infected with the virus . In order to further study the molecular pathogenesis of PEDV , the necessary reverse genetic manipulation technology platform is laid .

【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.65

【参考文献】