Cellulosimicrobium sp.木聚糖酶的纯化及其基因在毕赤酵母中的表达

发布时间：2018-01-19 19:08

  本文关键词： 木聚糖酶 分离纯化 酶学性质 毕赤酵母 可溶性表达　出处：《广西大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：木聚糖酶是一类降解木聚糖分子中β-1,4-木糖苷键的酶系,主要包括内切β-1,4-木聚糖酶和β-木糖苷酶。内切β-1,4-木聚糖酶以内切方式作用于木聚糖主链内部的β-1,4-木糖苷键,其主要水解产物为低聚木糖和少量木糖。不同来源木聚糖酶酶学特性存在明显的差异,其水解产物的特性也不完全相同,可广泛用于再生能源、啤酒酿造、饲料、食品、造纸等工业。本课题从实验室已筛选鉴定的一株产木聚糖酶的纤维微菌属(Cellulosimicrobium sp.XM-8)菌株出发,通过逐步的分离纯化其野生酶,最终得到一条具有木聚糖酶活性的蛋白条带命名为Xyn-8,并对该野生酶的酶学性质进行分析测定。结果表明该野生酶的最适温度60℃,最适pH值为5.0,其拥有良好的温度稳定性及pH稳定性;在50℃及以下温度条件中处理8h后仍剩余70%以上的酶活力,在pH4-10之间处理12 h后仍具有80%以上的酶活力;该酶具有很强的底物特异性,只对木聚糖底物有酶活力;5mM的Na~+、Mg~（2+）和Ba~（2+）对酶活性有轻微的激活作用,Ag~+、Hg~（2+）及化学试剂SDS对其有强烈的抑制作用,使其酶活几乎完全丧失。在最适条件下,测定可溶性底物Beechwood木聚糖的K_m和V_（max）为2.167±0.18 g/L,740.6±15.77μmol/min·mg~（-1）,以蔗渣木聚糖为不可溶性底物时K_m和V_（max）分别为7.91±0.56 g/L和806.8±21.34μmol/min·mg~（-1）。通过序列对比后设计简并引物克隆得到该木聚糖酶完整基因,该基因存在一个10家族的催化功能与和两个碳水化合物结合域,通过利用大肠杆菌系统进行表达时发现大量的目的蛋白以不可溶性的包涵体形式存在。结构域的分析表明该酶包含一个10家族的催化功能域与和两个碳水化合物结合域,为了获得大量可溶性表达以及探索碳水化合物结合域对热稳定性及其它酶学性质的影响,本实验将已克隆的完整基因Xyn-8a和去除碳水化合物结合域的基因Xyn-8c连接pPIC9K载体导入毕赤酵母GS115细胞中进行高密度发酵表达。实验结果表明Xyn-8a和Xyn-8c在毕赤酵母表达系统中获得了良好的可溶性表达。基因Xyn-8c Pastoris GS115中表达时比在大肠杆菌中表达,热稳定性有很大的提高,最适温度提高了10℃,温度稳定性由45℃处理0.5 h后残留50%酶活力,提高至55℃处理8 h仍有接近40%的酶活力。结果表明重组酶与底物的亲和力减小,而去除碳水化合物的重组酶最适温度及热稳定性有了很大的提高,推测可能是由于酵母表达系统中密码子亲和性以及进行的N-糖基化结构修饰不同于大肠杆菌表达系统,因此对酶学性质造成了影响。
[Abstract]:Xylanase (Xylanase) is a kind of enzyme system that degrades 尾 -1N 4-xylonoside bond in xylan molecule, mainly including 尾 -1N 4-xylanase and 尾 -xylosidase. Endoglycosidase. 4xylanase endonuclease digestion acts on the 尾 -1m4-xyloside bond in the main chain of xylan. The main hydrolytic products were xylooligosaccharides and a small amount of xylose. The enzymatic properties of xylanase from different sources were obviously different, and the characteristics of the hydrolysates were not completely the same, which could be widely used in renewable energy and beer brewing. Feed, food. In papermaking and other industries, a strain of Cellulosimicrobium sp.XM-8, which has been screened and identified in the laboratory, is used to produce xylanase. A protein band with xylanase activity was obtained by gradual isolation and purification of its wild enzyme, which was named Xyn-8. The results showed that the optimum temperature and pH value of the wild enzyme were 60 鈩，

本文编号：1445201