大鲵TLR7和MyD88基因结构、表达特征和功能的初步研究

发布时间：2018-01-19 22:42

  本文关键词： 中国大鲵 TLR7 MyD88 基因克隆 结构 表达特征 NF-κB　出处：《上海海洋大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：TLR家族作为先天性免疫的重要成员之一,是机体抵御病原微生物的第一道防线,TLR识别病原相关分子模式后,通过MyD88依赖途径或TRIF信号传导途径,激活转录因子NF-κB和干扰素调节因子,从而诱导炎症因子的产生。目前在人、鼠、非洲爪蟾、斑马鱼均已发现TLR家族成员。中国大鲵(Chinese giant salamander,Andrias davidianus)俗称娃娃鱼,是我国特有的珍稀两栖类,也是世界上体形最大的两栖动物。大鲵作为原始物种,具有水生向陆生过渡的进化特征和生理学特点,因此在研究物种起源、进化和免疫系统分子生物学等方面具有重要的研究价值。然而,近年来大鲵人工养殖的快速发展,养殖病害问题日渐突出,大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovius,GSIV)感染大鲵引起重大的经济损失。因此,开展大鲵病原生物感染与宿主防御机制研究,不仅具有重要的科学意义,也具有较为广泛的应用前景。与其他水生生物相比,目前对大鲵的免疫系统以及分子免疫学研究很少。本文运用RACE-PCR技术克隆了大鲵TLR7(CgsTLR7)和MyD88(CgsMyD88)基因的cDNA全长,分析其分子结构特征与功能,利用荧光定量PCR的方法检测CgsTLR7和CgsMyD88基因在健康大鲵组织中的表达模式,以及GSIV感染后免疫基因的应答规律。并对CgsMyD88蛋白在大鲵肌肉细胞(GS-M)中的定位及其过表达对NF-κB的诱导作了初步的研究,旨在为系统研究大鲵免疫系统进化、结构功能以及抗感染分子免疫机制等奠定基础。主要结果如下:1.以大鲵肾脏组织的总RNA为模板,采用RACE PCR扩增技术,克隆得到CgsTLR7和CgsMyD88 cDNA序列全长。分别为3747bp和1423bp,预测其开放阅读框分别为3150bp和879bp,分别编码1049和292个氨基酸;其中5'UTR分别为144bp和387bp,3'UTR分别为453bp和157bp。应用SMART软件预测其功能结构域,结果显示,CgsTLR7蛋白有一个胞外信号肽、19个亮氨酸重复区域以及一个胞内TIR结构域;CgsMyD88蛋白N端存在典型死亡结构域和C端TIR结构域。并且CgsTLR7和CgsMyD88的TIR都含三个保守的Box区域,用于信号的转导。序列比对分析结果显示CgsTLR7与巴西锦龟、非洲爪蟾和鸡的同源性分别为71%、64%和65%。CgsMyD88非洲爪蟾和巴西锦龟同源性最高,均为73%,与鸡的同源性为69%。分别将CgsTLR7和CgsMyD88推定的氨基酸序列与其它脊椎动物的构建系统发育树,二者结果相似,所构建的进化树均分为两支,一枝是鱼类,另一枝是哺乳动物、禽类、爬行类和两栖类。与非洲爪蟾聚为一枝,与巴西锦龟相距也较近。2.实时荧光定量PCR分析结果显示:CgsTLR7和CgsMyD88的mRNA在所检测的组织中均有表达。其中CgsTLR7 mRNA在肝脏组织中表达水平最高,肠表达量最低;CgsMyD88 mRNA在大鲵肾脏组织中表达水平最高,肌肉和肝脏组织中表达量最低。注射大鲵GSIV后,肾、脾的CgsTLR7的表达均出现明显上调,分别在12h、48h达到峰值。大鲵感染GSIV 6h后,脾脏中MyD88的表达量出现明显的上调,24h有所降低,48h表达量达到峰值,72h后表达量降低,但仍比对照组高;在肾脏组织中,感染GSIV 6h后,MyD88表达量有所降低,48h表达量最高。以上结果表明,CgsTLR7和CgsMyD88在大鲵天然免疫中可能起着重要作用。3.构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-MyD88转染大鲵肌肉细胞(GS-M),利用间接荧光免疫化学染色技术,以抗His抗体作为一抗染色,结果显示:CgsMyD88蛋白在细胞质中有大量表达,少部分分布在细胞核中。为了验证CgsMyD88是否能够激活转录因子NF-κB,将pcDNA3.1(+)-MyD88质粒、pNF-κB-Luc质粒和pRL-TK质粒共同转染于GS-M细胞,用双荧光素酶报告基因系统检测,结果表明,转染CgsMyD88报告基因活性是对组照组的1.88倍说明CgsMyD88能够激活下游的转录因子NF-κB活性。
[Abstract]:As an important member of the TLR family of innate immunity, is the body's first line of defense against pathogens, TLR recognize pathogen associated molecular patterns, through a MyD88 dependent pathway or TRIF signaling pathway, activation of transcription factor NF- kappa B and interferon regulatory factor, so as to induce the production of inflammatory factors. At present, rat. Xenopus laevis, a member of the TLR family have been found in zebrafish. China (Chinese giant salamander, the giant salamander salamander, Andrias davidianus) is a rare amphibian species endemic to China, is the world's largest body of amphibious animals. The giant salamander as primitive species, evolution characteristics and physiological characteristics of aquatic to terrestrial transition, so in study on the origin of species, has the important research value of immune system evolution and molecular biology and so on. However, the rapid development of artificial breeding of giant salamander breeding in recent years, the disease is Prominent, giant salamander iridovirus (giant salamander, iridovius, GSIV) infection of giant salamander caused a great economic loss. Therefore, to carry out the study of giant salamander pathogen infection and host defense mechanism, not only has important scientific significance, but also has extensive application prospects. Compared with other aquatic organisms, the little immune system to the giant salamander and molecular immunology research. This paper uses the RACE-PCR cloning of giant salamander TLR7 (CgsTLR7) and MyD88 (CgsMyD88) full-length cDNA gene and analysis of its molecular structure and function, detect the expression patterns of CgsTLR7 and CgsMyD88 gene by real-time fluorescence quantitative PCR method in health salamander tissues, and the immune response gene GSIV after infection and the CgsMyD88 law. Protein in giant salamander muscle cells (GS-M) in the localization and induction of NF- kappa B has made preliminary research on the expression, to study the immune system System evolution, lay the foundation for structure function and anti infection immune molecular mechanism. The main results are as follows: 1. with the total RNA of giant salamander kidney tissue using RACE as template, PCR amplification, cloned full-length CgsTLR7 and cDNA sequences. The CgsMyD88 were 3747bp and 1423bp, the predicted open reading frame were 3150bp and 879bp respectively, encoding 1049 and 292 amino acids; the 5'UTR were 144bp and 387bp, 3'UTR were 453bp and 157bp. using SMART software to predict the functional domain, results showed that CgsTLR7 protein has an extracellular signal peptide, TIR domain 19 leucine repeat region and a cytoplasmic CgsMyD88 protein; N end domain and C the typical structure of death terminal TIR domain and CgsTLR7 and CgsMyD88. TIR contains three conserved Box region for signal transduction. Sequence analysis results showed that the CgsTLR7 and Brazil Jin turtle, x.laevis and chicken The homology was 71%, 64% and 65%.CgsMyD88 of Xenopus laevis and Brazil Jin turtle highest homology were 73%, with chicken 69%. homology respectively to construct phylogenetic tree of amino acid sequences of CgsTLR7 and CgsMyD88 and other putative vertebrate, the results of the two similar constructed phylogenetic tree is divided into two branches one is, the other branches are fish, mammals, birds, reptiles and amphibians. And Xenopus laevis were clustered into one branch, and Brazil are also close to painted turtle.2. real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that CgsTLR7 and CgsMyD88 mRNA were expressed in all detected tissues. The CgsTLR7 mRNA in the liver the expression level is the highest, the lowest expression of intestinal CgsMyD88; mRNA in giant salamander kidney tissue expression level is the highest, the lowest expression in muscle and liver. After GSIV injection of giant salamander kidney, spleen, the expression of CgsTLR7 was up-regulated at points, In 12h, 48h reached the peak GSIV after 6h infection. The giant salamander, the expression of MyD88 in spleen was increased, 24h decreased, 48h expression reached the peak, the expression of 72h decreased, but still higher than the control group; in the kidneys, GSIV infection after 6h, the expression of MyD88 decreased 48h, the highest expression level. These results indicate that CgsTLR7 and CgsMyD88 may play an important role in.3. to construct the eukaryotic expression vector pcDNA3.1 in innate immunity in giant salamander (+) -MyD88 was transfected into giant salamander muscle cells (GS-M), using indirect immunofluorescence staining technique with anti His antibody as the first antibody staining, the results showed that: CgsMyD88 protein there are a lot of expression in the cytoplasm, a small part of the distribution in the nucleus. In order to verify whether the CgsMyD88 can activate the NF- transcription factor kappa B, pcDNA3.1 (+) -MyD88 plasmid, pNF- kappa B-Luc and pRL-TK plasmid were co transfected into GS-M cells, using double fluorescein The results showed that the enzyme reporter gene system detection, transfection of CgsMyD88 reporter gene activity is 1.88 times of that group group CgsMyD88 can activate the activity of NF- transcription factor kappa B downstream.

【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4;Q78

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本文编号：1445787