宏基因组来源酯酶基因的挖掘及其在非水相中催化性能的研究

发布时间：2018-01-22 16:05

  本文关键词： 宏基因组 功能筛选 酯酶 非水相催化 转酯反应　出处：《华东理工大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：自然环境中微生物分布广泛,种类繁多,蕴含着丰富的基因资源,但99%的微生物在目前实验条件下不易获得纯培养,宏基因组学不依赖微生物培养,提供了一个获取宝贵未培养微生物遗传资源的途径。酯酶作为一大类水解酶,广泛应用于不同的领域,具有很高的理论和实际应用价值,在生物催化方面展现出巨大的潜力。不同于脂肪酶,只有少数的酯酶应用于有机合成中。因而,利用丰富的微生物资源去开发新型且具有优良特性的酯酶,具有重要的现实意义和工业应用价值。基于以上目的,本研究致力于新型酯酶基因的开发,利用宏基因组学的方法对深海污泥中的酯酶基因进行筛选和分析,从中筛选得到了一个具有高活力和立体选择性的新型酯酶EST4,基于开发和实际应用的目的,将其成功用于在非水相中催化动力学拆分反应和用于合成工业上重要的乙酸酯类化合物,并通过固定化技术提高其催化稳定性。酯酶EST4显示的独特性质和良好的催化效果,证明是一个非常具有潜力的生物催化剂。具体研究结果如下：(1)本课题首先对深海污泥直接提取基因组用于构建Fosmid文库,库容量约40,000个克隆。基于功能活性的筛选方法,对该文库进行酯酶活性筛选,从中得到了34个阳性克隆表现出酯水解活性。通过对Fosmid质粒构建亚克隆文库的方法,最终获得5个新型的酯酶基因；将5个酯酶基因与NCBI数据库上已报道的脂类水解酶的氨基酸序列比对,其最高同源性在48%至79%之间。系统进化树分析表明,5个酯酶分别隶属于3个不同的酯酶/脂肪酶家族(Family IV, Family V和Family VIII)。这些新型的酯酶为后续的实验提供了材料。(2)对5个新型酯酶进行克隆并成功在大肠杆菌中实现可溶性表达。以三丁酸甘油酯为底物进行活性筛选,得到水解活性最高的酯酶EST4。通过酶学性质研究表明：EST4偏好作用于短酰基链长(C2～C10)的对硝基苯酚酯,以对硝基苯基丁酸酯水解活性最高；最适水解温度为45℃,最适pH为8.0,水解比活为1389 U/mg；EST4在45℃的半衰期为46 h,具有较好的热稳定性；表面活性剂和金属离子均对EST4的活性无促进作用,是不依赖金属离子的酯酶；同时在有机溶剂中表现出良好的耐受性,尤其是在疏水性溶剂中,30℃处理12 h后仍然保持90%以上残余酶活。酶学特性研究为EST4的工业化应用提供了一定的基础,尤其是有机溶剂耐受性和热稳定性方面,对于非水相催化非常有利,为后续的催化反应奠定了基础。(3)光学纯的仲醇作为一类重要的手性中间体,是生产药物的重要手性砌块,可以转化为重要的生物活性分子,利用酯酶催化手性化合物拆分制备光学纯手中间体是一种有效途径。以α-苯乙醇为模式底物,通过优化酯酶EST4拆分反应的关键性因素,最终确定了在正己烷中,以丁酸乙烯酯为酰基供体,在30℃下,10mg/mL投酶量,底物与酰基供体摩尔比1：3时,EST4能发挥最高催化特性同时能获得大于99.9%ee底物醇且E200。EST4在动力学拆分中表现出非常广的底物谱,基于转酯反应,在最优反应条件下,EST4能高效拆分α-苯乙醇衍生物、不同侧链长度的芳香醇和杂环醇(邻位取代α-苯乙醇衍生物除外),底物ee值大于99.9%,一半以上底物E值大于200。此外,为考察工业应用潜力,在高底物浓度下利用EST4进行拆分反应,EST4表现出高底物浓度耐受性,浓度至1M时,仍然能获得大于99%ee的手性醇同时转化率接近理论转化率50%。酯酶EST4表现出对仲醇的高活性和高对映选择性,使其成为工业化生产手性中间体的潜在用酶。(4)乙酸酯类化合物作为重要的香精香料分子,具有典型的水果香味和高挥发性,被广泛应用于食品和化妆品行业。以EST4的冻干细胞作为全细胞催化剂,用于催化乙酸酯类化合物的合成反应,其最优条件为：以log P 3.5的正己烷为反应介质,乙酸乙烯酯为酰基供体,底物摩尔比为1：2,在40℃下,反应90 min,即可将100 mM肉桂醇100%转化完全；同时,EST4对肉桂醇底物具有良好的耐受性,在2.5M(335g/L)浓度下依然能保持高催化活性,且反应12h内转化率大于98%,有效缓解生产过程中出现的底物产物抑制现象；除肉桂醇外,EST4对其他类型的醇同样能耐受较高的浓度,对2.0 M香茅醇和3.0 M异戊醇反应12h后的转化率可达97%以上。底物谱研究发现,EST4对不同结构类型的伯醇、仲醇具有较高的转酯活性,是一个非常适合转酯反应的广谱底物适应性酯酶,具有广泛的应用性。(5)在酯酶EST4共价固定化研究方面,首先通过硫酸铵沉淀的方法对EST4粗酶液进行纯化和回收并对其浓度进行优化,最终确定50%(w/v)的硫酸铵浓度,酶活收率高于98%；选取不同类型的氨基和环氧基载体,以酶活和固定化效率为筛选标准,筛选得到了最佳氨基载体NH；通过单因素优化固定化条件,确定了氨基载体NH固定化EST4的最佳条件：100 mM pH8.0磷酸盐缓冲液,在20℃ 200 rpm下,每克载体20 mg的蛋白量固定3 h。以肉桂醇的转酯反应为研究对象,对固定化酶的操作稳定性进行研究,结果表明,固定化酶在连续反应11个批次后,仍然保持90%以上的残余酶活,提高了其在生物催化过程的稳定性,有望在生物合成和有机合成领域得到广泛的应用。
[Abstract]:A novel esterase EST4 with high activity and stereoselectivity has been screened and analyzed . The results showed that EST4 had the highest hydrolytic activity , the optimum hydrolysis temperature was 45 鈩，

本文编号：1455129