多基因共稳定表达筛选载体与siat7e稳转MDCK细胞株的构建

发布时间：2018-01-22 20:07

  本文关键词： IRES 载体构建 基因共表达 MDCK细胞 siat7e基因　出处：《聊城大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：科学研究中构建稳定表达细胞株,抗体工程和细胞工程领域筛选种子细胞经常需要两个或以上的基因稳定共表达。通常通过两个载体共转染的筛选方法来实现,然而实践中常面对许多问题。因此,有必要开发单个载体实现多基因共同表达。MDCK细胞作为流感病毒疫苗生产的重要细胞系之一,广泛应用于多种病毒的扩增与纯化。但是MDCK细胞贴壁依赖性强,需要表面粘附来进行增殖。因此实现MDCK细胞于悬浮培养中增殖,将简化病毒生产过程,并极大地促进流感病毒的生产规模。本文第一部分是基于IRES序列的多基因共稳定表达筛选载体构建。目的:构建一个IRES序列介导的多基因共表达载体,实现两个目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达,提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。方法:以实验室前期构建的载体pLV-MCS-Puro为骨架,设计并全基因合成双基因克隆表达元件,连接到骨架载体,构建多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,以DsRed2和EGFP荧光蛋白基因验证该载体用于多基因稳定共表达细胞株筛选的效率。结果:成功构建了pLV-2MCS-Puro载体以及DsRed2和EGFP共表达重组质粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬时转染实验证明该载体能介导多基因共表达。抗性筛选获得了MDCK和Hela两种细胞的多基因稳定共表达细胞池。细胞池涂片荧光显微镜观察和计数表明抗性细胞池DsRed2和EGFP双阳率接近100%。基因组和转录水平PCR及蛋白免疫印迹实验表明DsRed2和EGFP稳定整合到抗性细胞基因组并且两种蛋白表达水平较为一致。结论:成功构建了多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro,实现了两个目的基因和抗性基因串联共表达,并且具有高效的多基因稳定共表达细胞株筛选效率。该载体在研究蛋白相互作用以及工程细胞构建等方面具有一定的应用前景。本文第二部分是siat7e基因稳定表达的MDCK细胞株的构建。目的:本章节拟构建表达siat7e的MDCK细胞株,用以解决MDCK细胞的悬浮培养问题。方法:利用PCR技术,从MDCK细胞基因组中扩增出全长1011bp的siat7e基因,并将该基因分别克隆到pBflag、pLV-MCS-Puro和pSF-EGFP表达载体中,三种真核表达载体转染MDCK细胞后,筛选siat7e基因稳定表达的MDCK细胞株,以期实现MDCK细胞适应无血清悬浮培养。结果:成功构建了pBflag-siat7e、pLV-siat7e-Puro、pSF-EGFP-siat7e三种表达质粒。pBflag-siat7e重组质粒转染MDCK细胞,抗性筛选获得四个克隆,蛋白质印记和基因组PCR未见siat7e目的条带,推测可能未筛选到siat7e阳性克隆,且细胞未见明显表型。pLV-siat7e-Puro重组质粒转染MDCK细胞,抗性筛选获得MDCK耐药细胞池。基因组和转录水平PCR都证明目的基因siat7e稳定整合到MDCK细胞基因组。同样细胞未见明显表型,降低血清或者无血清培养基培养耐药性MDCK细胞,未获得适应悬浮培养的MDCK细胞系。利用pSF-EGFP-siat7e重组载体,融合表达EGFP和siat7e蛋白,荧光定位siat7e蛋白。荧光倒置显微镜下观察EGFP荧光蛋白表达情况,验证siat7e基因成功转染至MDCK细胞。基因组和转录水平PCR验证,证明siat7e基因稳定整合到MDCK细胞基因组。蛋白荧光定位验证siat7e表达的唾液酸转移酶蛋白定位在内质网上。结论:成功构建了三种表达质粒,并成功筛选获得两种稳定表达siat7e基因的MDCK耐药细胞池,且成功验证唾液酸转移酶蛋白定位,但细胞未见明显表型。接下来,将进一步研究重组质粒转化后MDCK细胞适应悬浮培养的特性。本研究构建的siat7e基因真核表达载体,在转染MDCK细胞后,若能使MDCK细胞适应悬浮培养,将极方便应用MDCK细胞大规模生产流感病毒疫苗。
[Abstract]:A recombinant plasmid pLV - 2MCS - Puro has been successfully constructed . Two stable MDCK cells stably expressing siat7e gene were successfully screened , and the siat7e gene was successfully verified . However , the cells did not meet the obvious phenotype . Next , we will further study the characteristics of MDCK cells in suspension culture . After transfection of MDCK cells , MDCK cells can be used for suspension culture , and MDCK cells can be used to produce influenza virus vaccine on a large scale .

【学位授予单位】：聊城大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q78

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本文编号：1455632