旋毛虫成虫DNase Ⅱ-T3223-7基因的克隆及其特性鉴定

发布时间：2018-01-23 02:02

  本文关键词： 旋毛虫 DNase Ⅱ 原核表达 多克隆抗体 酶活性 免疫定位　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：旋毛虫是一种典型的人兽共患寄生线虫,其逃避宿主的先天性免疫防御机制一直是该领域的研究热点。近年来公布的旋毛虫基因组揭示了旋毛虫拥有125个庞大的DNase Ⅱ(Deoxyribonuclease Ⅱ)家族蛋白,并且一半以上的基因被认为编码排泄/分泌(Excretion/Secretion,ES)产物。旋毛虫具有如此庞大的DNase Ⅱ家族蛋白,但对其存在的功能和作用却鲜有研究。目前的研究已证实,不同时期的旋毛虫ES产物都具有核酸酶活性,而成虫期和新生幼虫期的核酸酶活性明显强于肌幼虫期。本实验室前期利用基因探针从不同时期的旋毛虫基因库中获得28条期特异性DNase Ⅱ基因,将其归为三类,分别是新生幼虫期(Newborn larva,NBL)T31D4、肌幼虫期(Muscle larva,ML)P43、和成虫期(Adult worm,Ad)T3223。本研究选择旋毛虫成虫期的核酸酶基因T3223-7进行研究,利用原核表达系统,对旋毛虫成虫期的T3223-7进行表达、鉴定,并对表达产物进行酶活性验证。首先,对Gen Bank中旋毛虫T3223-7基因序列进行生物信息学分析。根据基因序列设计T3223-7特异性引物,然后用RT-PCR技术克隆得到T3223-7基因,构建p ET-28a-T3223-7重组表达质粒,转化至大肠杆菌Rosseta(DE3)。通过IPTG诱导表达获得重组蛋白r T3223-7。重组蛋白的分子量为39.7 k Da,与理论值一致。通过His Trap纯化柱和凝胶切割回收法纯化重组蛋白,得到高纯度蛋白。其次,利用1D酶谱验证T3223-7重组蛋白的核酸酶活性。根据实验结果选择缓冲液p H5.0作为最佳反应孵育条件。为了验证该蛋白酶活性是否依赖二价阳离子,反应孵育液选用两种情况:Ca 2+存在和EDTA存在。酶活性试验结果表明,在酸性条件(p H=5.0)下,T3223-7蛋白具有降解DNA的能力,并且核酸酶活性在含有Ca~（2+）或EDTA的两种反应溶液中都稳定存在。结果证实,旋毛虫的DNase Ⅱ具有核酸酶活性,挑战了先前的预测,即认为旋毛虫DNase Ⅱ不具备典型的组氨酸活性位点而不具有酶活性。最后,我们用r T3223-7蛋白免疫家兔,获得多克隆抗体。经过ELISA测定抗体效价高达1:32 0000。通过Western blot分别检测r T3223-7、天然虫体蛋白和ES产物与r T3223-7抗血清的抗原识别性,结果显示,T3223-7重组蛋白抗血清不仅能识别r T3223-7,还能特异性识别并结合天然虫体抗原和ES产物中的抗原。另一方面,制备旋毛虫成虫切片、裸虫和虫体与肠道组织进行免疫荧光定位,免疫荧光结果显示,红色荧光信号定位在虫体表皮,虫体周围的宿主肠道组织上也有少量抗原被识别,根据这些结果推测,T3223-7可能是一种由表皮细胞合成表达的核酸酶蛋白,参与宿主的免疫逃避或成虫发育的蜕皮过程,降解体外对宿主免疫应答起到作用或可能引起免疫反应的DNA成分,以利于旋毛虫在宿主体内的寄生。
[Abstract]:Trichinella spiralis is a typical zoonotic parasitic nematode. The innate immune defense mechanism of Trichinella spiralis has been a hot topic in this field. The genome of Trichinella spiralis published in recent years revealed that Trichinella spiralis has 125 huge DNase 鈪，

本文编号：1456377