魔芋内参基因筛选及HSFA1基因表达分析

发布时间：2018-01-23 08:06

本文关键词： RT-qPCR 内参基因魔芋 HSFA1 基因表达　出处：《西南大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)目前是分析基因表达的常用方法,而稳定的内参基因是准确定量基因表达水平的先决条件。魔芋是我国西南地区的一类价值较高的蔬菜作物,研究魔芋中一些重要的功能基因对魔芋遗传改良有重大帮助。由于基因组数据的限制,魔芋中尚未筛选出稳定的内参基因,内参基因的筛选能够为后续重要功能基因的表达分析提供重要的理论支撑,有着重要的理论和应用价值。此外,魔芋是一种不耐热的作物,目前只适应在中高海拔地区种植,研究魔芋热害胁迫下主调控因子Heat shock transcription factor A1(HSFA1)基因的表达情况,有助于了解魔芋的耐热调控机制,对魔芋耐热改良有重要的理论帮助。以白魔芋(Amorphophallus albus)和花魔芋(Amorphophallus konjac)为试材,采用同源克隆法,克隆了包括Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)、Elongation factor 1-α(EF1-a)、Eukaryotic initiation factor 4A(EIF4A)、H3.2 histones(H3)、Cyclophilin(CYP)、β-Actin(ACTB)、β-Tubulin(TUB)、Ubiquitin(UBQ)、Ribosomal protein L16(RP)在内的9个候选内参基因及HSFA1基因保守区部分序列,鉴定了候选内参基因在热害胁迫、雨涝胁迫及不同组织间表达的稳定性,通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了HSFA1基因的全长,预测了其编码读码框,并通过洋葱表皮亚细胞定位实验鉴定了魔芋HSFA1基因的亚细胞定位模式。同时以筛选出的稳定的内参基因组合作为内部对照,分析了两个魔芋种的不同组织中(叶和根)HSFA1基因在41℃高温处理0-8 h时的相对表达情况。主要结果如下:1、克隆了白魔芋、花魔芋中9个内参基因采用同源克隆法,根据NCBI中亲缘关系较近物种的同源保守序列,从两个魔芋种中克隆出其他作物中9个常用内参基因(GADPH、ACTB、RP、UBQ、H3、TUB、CYP、EIF4A、EF1-α)的编码区保守性片段。根据测序结果,预测了编码的氨基酸残基,通过构建发育树,比较了物种之间的亲缘关系,结果显示,与魔芋亲缘关系最近的是天南星科中的花烛等植物,这些植物与魔芋同科,此外与魔芋亲缘关系较近的还有单子叶植物棕榈科的非洲油棕(Elaeis guineensis)、海枣(Phoenix dactylifera)及芭蕉科的野生芭蕉亚种(Musa acuminata subsp.)等,这为魔芋相关基因的同源克隆提供了借鉴。2、比较了三种实验条件下两个魔芋种中稳定的内参基因应用RT-qPCR技术,设计定量引物,计算了不同组织间、热害胁迫及雨涝胁迫下候选内参基因表达Cq值。根据geNorm、NormFinder、BestKeeper三个算法计算了不同候选基因的稳定值,并比较了稳定值结果,鉴定了不同实验情况下(热害胁迫、雨涝胁迫及不同组织间)两个魔芋种中稳定内参基因。结果表明EF1-α和EIF4A是所有集合中最稳定的2个内参基因,EF1-α、EIF4A、H3和UBQ是热害胁迫下较稳定的内参基因;EF1-α、EIF4A和TUB是雨涝胁迫下最稳定的内参基因;EF1-α、EIF4A和CYP是不同组织间最稳定的内参基因。3、分离到两个魔芋种的HSFA1基因依据保守氨基酸序列和密码子的偏好性,设计简并引物,分离得到长1221 bp的基因片段。利用RACE技术分离到魔芋HSFA1上游及下游片段,拼接结果发现该基因全长为1909 bp,ORF finder预测了1569 bp的开放阅读框,编码了522个氨基酸残基,通过设计全长引物,验证了RACE扩增结果准确性。结构域分析显示该基因具备与其他物种HSFA1基因相似的结构域,C端含有AHA基序,能够激活下游基因表达;生物信息学预测其与单子叶植物的亲缘关系较近,但相似度均在81%以下;跨膜结构预测其不含有跨膜结构。4、分析了两个蛋白在洋葱表皮细胞中的定位情况通过构建pCHF3-AkHSFA1-YFP和pCHF3-AaHSFA1-YFP融合表达载体,确定了在洋葱表皮细胞的定位情况,发现两个蛋白主要定位于细胞核和细胞质中。5、鉴定了两个魔芋种中HSFA1基因不同组织的相对表达模式对魔芋材料41℃高温处理,应用RT-qPCR技术,以EF1-α+H3+UBQ作为内参基因,分析了0-8 h HSFA1基因在白魔芋和花魔芋叶片和根两个组织中表达情况,发现HSFA1的表达水平在2个中整体呈现出增强的趋势,均在热处理2 h时表达达到顶峰,说明了魔芋为热敏感型作物;不同组织间比较发现,该基因在叶片中的表达量远高于根中,表明HSFA1在叶片中的表达丰度高;两个种之间的表达量比较发现,AaHSFA1的表达量在不同时段均高于AkHSFA1,从分子生物学角度进一步说明了白魔芋耐热性强于花魔芋。综上,本研究的结果为魔芋基因表达分析与耐热调控网络的解析提供了重要的理论参考及技术支持。
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【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S632.3

【参考文献】