携带hTERT-P2A-EGFP基因的真核表达质粒的构建及鉴定

发布时间：2018-01-24 23:02

  本文关键词： 人端粒酶逆转录酶 绿色荧光蛋白 质粒构建　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的构建真核表达质粒pRRL-hTERT-P2A-EGFP,探讨重组质粒在HEK293FT细胞中的表达和转染效率。为进一步研究hTERT基因的功能及构建永生化细胞系奠定基础。方法真核质粒pRRL-hTERT-P2A-EGFP的构建:(1)以pBABE-puro-hTERT和pRRL-EGFP质粒为模板利用PCR技术分别扩增目的基因hTERT、P2A和EGFP,对PCR产物进行胶回收纯化。(2)以凝胶回收的3个目的片段为模板,采用重叠PCR法获得目的片段hTERT-P2A-EGFP。(3)载体pRRL-与目的片段hTERT-P2A-EGFP酶切处理后进行重组反应。(4)重组质粒的序列测定和定点突变,设计含有突变位点正确碱基的引物,利用FastDigestDpnⅠ,进行定点突变。真核质粒pRRL-hTERT-P2A-EGFP的鉴定:(1)复苏冻存的HEK293FT细胞,并进行传代培养。(2)经脂质体介导重组质粒转染到HEK293FT细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达。(3)利用流式细胞仪检测重组质粒在HEK293FT细胞中的转染效率。(4)四质粒系统包装病毒,利用lipo2000将已合成的所需质粒转染到293FT细胞系中,收集病毒进行浓缩、滴定、流式检测,从而获悉病毒滴度及感染力。(5)重组病毒感染人胚胎肝脏细胞后,提取细胞RNA,RT-PCR法检测细胞hTERT基因的表达水平。结果1.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示目的基因hTERT、P2A和EGFP的片段分别为3500、110和720bp,与预期结果一致。2.目的基因片段hTERT-P2A-EGFP的电泳结果约4300bp,与预期片段大小一致。3.测序结果显示,目的基因1547位点发生了突变。利用定点突变技术成功诱变,再次测序后目的基因序列与GenBank公布的基因序列完全一致。4.重组质粒pRRL-hTERT-P2A-EGFP酶切鉴定,电泳产生约4300bp目的条带,质粒构建成功。5.重组质粒pRRL-hTERT-P2A-EGFP转染HEK293FT细胞24h后,在荧光显微镜下可以观察到细胞中有绿色荧光产生。6.流式细胞检测结果显示重组质粒转染HEK293FT细胞的效率为44.8%。7.浓缩后的hTERT病毒液10μL感染细胞,流式细胞检测293FT细胞GFP的阳性率为32.7%,经计算重组慢病毒的滴度为1.6×107。8.hTERT慢病毒感染人胚胎肝脏细胞后,RT-PCR检测实验组的hTERT基因的表达较对照组有明显升高。结论1.目的基因hTERT-P2A-EGFP的序列与GenBank公布的基因序列一致。2.经酶切鉴定后,重组质粒pRRL-hTERT-P2A-EGFP构建成功。3.重组质粒转染HEK293FT细胞后,可在细胞内表达。4.慢病毒感染细胞后,hTERT基因的表达量升高。
[Abstract]:Objective to construct eukaryotic expression plasmid pRRL-hTERT-P2A-EGFP. To investigate the expression and transfection efficiency of recombinant plasmid in HEK293FT cells, and to lay a foundation for further study on the function of hTERT gene and the construction of immortalized cell line. Methods the eukaryotic plasmid pRRL-hT was used to construct an immortalized cell line. Building ERT-P2A-EGFP:. (. 1) the target gene hTERT was amplified by PCR using pBABE-puro-hTERT and pRRL-EGFP plasmids as templates. P2A and EGFP, the products of PCR were recovered and purified by gel. 2) the three target fragments recovered by gel were used as templates. The target fragment hTERT-P2A-EGFP.3 was obtained by overlapping PCR method. The recombinant plasmid pRRL- was sequenced and mutated by site-directed mutagenesis after digesting with the target fragment hTERT-P2A-EGFP. A primer containing the correct base at the mutation site was designed and FastDigestDpn 鈪，

本文编号：1461271