下咽癌FaDu细胞放疗抵抗细胞系的建立与IncRNA和mRNA表达谱的基因芯片分析

发布时间：2018-01-26 23:34

本文关键词： 下咽癌 FaDu 放射抵抗 mRNA lncRNA 基因芯片　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景下咽癌是头颈部恶性肿瘤中常见的一种,此类疾病患者早期症状不明显,临床就诊时常累及舌根、喉腔、颈段食管等邻近部位,并多伴有颈部淋巴结的转移,临床分期较晚。晚期肿瘤手术后可能影响发音、吞咽等功能,严重降低患者的生存治疗,并有部分患者肿瘤侵犯颈部动脉者无法手术,需要行放化疗。目前,下咽癌的治疗是手术联合放化疗的综合治疗,多数患者术后需要接受放疗,但肿瘤细胞的放射敏感性降低极大限制了放射治疗的预后。肿瘤的放射敏感性或抵抗性与体内某些基因的表达调控。放射线对肿瘤细胞的杀伤作用,其原理主要是通过射线的电离辐射作用引起细胞内DNA的损伤和与细胞凋亡有关的基因和蛋白的改变,而以此启动肿瘤细胞的凋亡过程。肿瘤细胞对放射线的敏感性差异,取决于不同的组织的细胞学类型,同一组织学类型中细胞分化程度的不同,以及同组织类型同一分化程度的细胞中某些调控基因的表达不同。基因芯片技术其原理是利用DNA碱基对的互补原理,提取样品中的RNA,通过逆转录取得被荧光标记的cDNA,与目标芯片进行杂交后,对载体进行激光共聚焦扫描,检测芯片上各点的荧光强度,利用软件分析大数据,推算样品中各基因的表达水平。在众多基因片段中分析寻找有特异表达的基因,为疾病的阐述提供部分理论依据。目的本研究通过不同剂量X线照射FaDu细胞株后,筛选出具有放射抵抗性的FaDu细胞系,分析其放射敏感程度,作为下一步实验研究的材料。肿瘤细胞对放射线敏感性的差异与受基因表达有关,基因表达又受多种调控因子的干预。因此,对具有放射敏感差异的不同细胞进行基因表达谱分析,可以发现与下咽癌放射敏感性密切相关的基因,通过干预这些基因,以制定下咽癌患者的个体化治疗方案。研究通过应用含人类全基因组序列的寡聚核昔酸芯片对FaDu和FaDu抵抗细胞株进行检测,根据两者芯片表达的差异,筛选出有差异的基因并对其进行初步验证,以寻找与下咽癌放射敏感性相关的基因。方法应用梯度剂量射线(2Gy,4Gy,6Gy,8Gy, lOGy各2次)多次照射建立人下咽癌放射抵抗FaDu-RS细胞。通过计算克隆形成率,流式细胞仪等技术分析FaDu细胞系与FaDu-RS细胞系的差异。确定FaDu与FaDu-RS细胞系有放射敏感性差异后,应用北京博奥晶典生物技术有限公司提供的博奥晶芯LncRNA Human Gene Expression Microarray V4.0,4x180K芯片检测FaDu细胞系与FaDu-RS细胞系接受X线照射后的基因表达谱变化,筛出两者比较有统计学差异的基因。为获得更为精准的数据,我们对两组细胞系放射性照射4Gy后0小时、2小时、48小时三个时间点的细胞分别进行芯片分析。然后使用Agilent GeneSpring软件对数据进行分析处理,应用KOBAS系统对所得差异mRNA和lncRNA进行生物学通路预测。寻找与下咽癌放射敏感性相关的主效基因,探索其放射抵抗发生的分子机制。结果1.克隆形成实验示FaDu-RS和FaDu在放疗的敏感性方面有显著性差异,FaDu-RS的放疗抵抗性明显增强。2.芯片数据显示在射线照射48小时后的分析中有1714条差异表达的lncRNAs(与FaDu相比,有759条lncRNAs在FaDu-RS中表达显著增高,有955条lncRNAs在FaDu-RS中显著降低)；此外,有2521条差异表达的mRNAs(在FaDu-RS中有1089条mRNAs表达显著增高,有1432条mRNAs表达显著降低)。再结合0小时、2小时的芯片分析结果,寻找在个时间点中FaDu与FaDu-RS均有差异表达的mRNA和lncRNA,我们发现有212条mRNA有共同显著差异,85条lncRNA有共同显著差异。3.应用KOBAS (KEGG Orthology Based Annotation System)预测分析,照射后48小时的差异mRNAs的生物学功能与44条细胞通路相关,G0分析发现247条与生物进程相关,41条与分子功能相关,15条与细胞组成相关。根据lncRNA和mRNA的共表达分析,共筛选出132条有统计学意义的lncRNA和mRNA共表达对。结论1. FaDu-RS细胞较FaDu细胞的放射敏感性低,FaDu-RS细胞具有放射抵抗性。2. lncRNA和mRNA在FaDu和FaDu-RS在放疗反应中有差异表达,FaDu-RS细胞放射敏感性的分子机制极其复杂,是多基因、多通路协同作用的结果,涉及到细胞细胞通信、肿瘤坏死因子途径、翻译后蛋白修饰、小分子RNA的转录后沉默、P53信号通路等多种遗传学及生物学改变。3.聚类分析得出的差异表达基因可能与FaDu细胞系放射敏感性密切相关。对有显著差异的表达基因及调控通路的进一步研究将有助于理解下咽癌细胞放射抵抗发生的生物学机制,为肿瘤的个体化治疗提供新的靶点及思路。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.63

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