实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立 (1)

发布时间：2016-10-20 19:23

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第29卷　第8期　　陈　颖等:实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立

实时荧光定量PCR技术检测转基因大豆方法的建立

陈　颖1　徐宝梁1　苏　宁1　王　媛2　王丙武1　葛毅强3

3

1(中国进出口商品检验技术研究所,北京,100025)　2(中国农业大学食品学院,北京,100049)

3(科技部中国农村技术开发中心,北京)

综

述与专题评论

摘　要　采用实时荧光定量PCR技术,,LectinEPSPS公司生产的商

该方法的检测灵敏度<0101%,是

100倍。荧光定量PCR,转基因大豆,转基因检测

　　随着近年来人们对转基因作物安全性的日益重视,对转基因产品检测方法的研究发展十分迅速,转基因产品的定性检测技术已由筛选检测深入为对目的基因的特异性检测。与此同时,随着各国有关GMO(geneti2callymodifiedorganism)标签法的建立和不断完善,转基因成分的准确定量检测也显得日趋重要,很多国家不但要求对转基因产品进行定性检测,还需要对产品中的GMO含量进行定量检测,以便标识。挪威是世界上第一个要求对转基因产品进行含量标识的国家,该国对转基因的限量为2%[1];欧盟和瑞士规定食品中GMO成分超过1%则必须进行标识;日本的限量标识为5%[2,3]。

目前,定量PCR检测方法是对转基因产品进行定量标识的主要方法。但传统PCR定量方法如内参照法、竞争法和PCR2ELISA法都是终点检测,即PCR到达平台期后进行检测,PCR经过对数期扩增到达平台期时,检测重现性较差。因此,传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。而实时荧光定量PCR技术(real2timefluorescencequantitativePCRdetection)是近几年兴起的分子生物学检测技术,于1996年由美国Ap2pliedBiosystems公司推出。与常规PCR相

　第一作者:博士,高级工程师。3科技部社会公益研究专项资金项目　收稿时间:2003-04-14,改回时间:2003-07-07

比,该技术实现了PCR

从定性到定量的飞跃,而且,它具有特异性更强、有效解决PCR

污染问题、自动化程度高等特点。

实时荧光定量PCR比常规PCR多一个寡聚核苷酸探针,该探针与摸板特异性结合,并带有一个荧光发光分子和一个荧光淬灭分子,完整的探针在激光激发下,发光分子所产生的荧光被淬灭分子全部吸收,样品无荧光,而PCR扩增过程中,Taq酶分子在链延长的过程中可以通过自身的5’23’核酸外切酶降解与模板结合的特异性荧光探针,使得荧光发光分子从探针上切下来而与荧光淬灭分子分开,从而在激光激发下产生特定波长的荧光,模板每复制一次,就有一个探针被切断,伴随一个荧光信号的释放。所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。由于被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系,因此用该技术可对模板进行准确定量。

本文通过应用荧光定量PCR技术对Roundup2Ready大豆的检测,旨在建立一种简便、快速的大豆食品转基因成分及含量的检测方法,为我国农业转基因生物标识的监管提供有力的技术支持。

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综述与专题评论

食品与发酵工业　　FoodandFermentationIndustries　　Vol129　No18

1　材料与方法

111　实验材料11111　样　品

11211　DNA的提取

按DNA试剂盒所述方法提取样品

DNA,经核酸蛋白分析仪测定浓度后,将其稀释为终浓度50ng/μL,备用。11212　PCR转基因成分含量分别为5%、2%、1%、

015%、011%、0%的转基因大豆RoundupReady标准品购自Fluka公司(Switzerland)11111

μL,其中L,脱氧核苷酸三磷酸TP(10mmol/L)2μL,引物(20μmol/L)各1μL,模板DNA(50ng/μL)2μL,Taq聚合酶2U,扩增条件为预变性94℃3min;变性94℃45s,退火60℃30s,延伸72℃1min,后

TaqManUni2

versalPCRMasterMix购自美国ABI公司;DNA提取试剂盒WizardGenomicDNAPu2rificationKit购自美国Promega公司。11113　主要仪器与设备

离心机,涡旋振荡器,恒温箱,核酸蛋白分析仪(BIO2RAD),定量PCR仪(ABI7700)。112　实验方法

延伸72℃7min,35个循环。

11213　实时荧光PCR检测1121311　扩增用引物

定量检测所用引物[4]、探针均由上海生工公司合成(见表1)。

扩增产物长度

()

118

表1　转基因大豆定量PCR扩增所用引物和探针

基因名称

Lectin

基因性质内　源

引物/探针序列

5’2ctcttcccgagtgggtgagga23’5’2cgattccccaggtatgtcga23’

5’2tgatgtgatatctccactgacg23’5’-tgtatcccttgagccatgttgt23’

CP4EPSPS外　源172

1121312　扩增反应体系及条件

实时定量PCR扩增采用ABI公司提供的试剂盒,反应体系见表2。扩增反应采用2

步法,具体条件为预变性95℃10min。扩增95℃20s,60℃1min,40个循环。

表2　ABI试剂盒定量扩增体系

试剂名称

MasterMix

Ready转基因大豆标准品(5%、2%、1%、015%、011%、0%)的测定,计算机自动生成

贮备液浓度

-

加入PCR反应体系的体积/μL

10

引　物

探　针模板DNA

水

μmol/L20μmol/L10

50ng/μL

-

各015

12

补足至总体积为25

11214　定量PCR结果计算1

121411　标准曲线的制定

通过对不同转基因含量的Roundup66

标准曲线,纵坐标为临界循环值Ct,横坐标

为百分含量。根据标准曲线所得的线性计算公式,将样品的Ct值代入公式,即可得到待测样品的转基因成分的百分含量。1121412　检测低限的测定

为测定该方法对转基因大豆检测的检测低限,取011%的转基因大豆标准品20mg,0%的标准品20mg,充分混匀,得到0105%的转基因标准品;取011%的标准品4mg,0%的标准品36mg,充分混匀,得到0101%的转基因标准品。扩增从015%、011%、0105%与0101%标准品中提取的DNA,得到相应的Ct值。根据标准曲线判断定量检测转基因大豆的检测低限。

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1121413　检测方法精密度分析

用已知转基因成分含量为2%、015%、

0105%的大豆标准品样品,重复检测10次。根据相应的标准曲线,得到被检测样品的转基因百分含量。通过对所得数据的统计学分析,如标准偏差、变异系数等,评价本检测方法的精密度。

标准偏差(RSD)=

(2+-n-和临界循环值(Ct,cyclethreshold)均可反映扩增的效果。Ct值是指每个反应管内的荧光信号(Rn)到达设定的域值时所经历的循环数。研究表明,Ct值与该模板的起始拷贝[6],Ct,模板,模板C<时,即

综述与专题评论

CV)SD/X×100%

其中:d1～dn为样品1～n次测量所得转基因成分含量,%;X为样品1～n次测量所得转基因成分的算术平均值,%;n为样品测量次数;SD为标准偏差。1121414　检测回收率计算

回收率/%=C1/C2×100%其中:C1———样品测量所得转基因成分含量的平均值;C2———被测样品的实际转基因成分含量。

,。由于模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在的线性关系,因此利用已知浓度的标准品即可作出该线性关系的标准曲线,其中横坐标代表已知浓度的对数,纵坐标代表Ct值。

用不同转基因含量的RoundupReady转基因大豆标准品对转入的外源CP4EPSPS基因[7]进行定量检测,以获得标准曲线(见图1)。通过Ct值检测软件自动生成以Ct值为纵坐标,以百分含量的对数为横坐标的标准曲线,所测得的标准曲线的方程式为Y=-31176X+261006,相关系数

R2为01991。这样,将待测样品扩增得到的Ct值

(Y值)代入公式,即可得到待测样品的转基

2结果与分析

211　大豆内源Lectin基因定性

提取出一定数量的高质量DNA是进行转基因成分PCR检测的前提条件。通过检测内源特异参照基因(内源基因),可以判定DNA是否被提取出来,或所提DNA是否适合于进行PCR扩增,从而可以避免检测结果的假阴性。因此,对大豆内源基因Lectin[5]的检测即是对被检测样品DNA提取质量的检测。

本研究通过采用特异引物首先对转基因大豆中的内源基因进行了定性PCR检测,以确定所提取的DNA是否适合于PCR扩增。PCR电泳显示:转基因成分含量分别为5%、2%、1%、015%、011%、0%的转基因大豆,均扩增出了118bp片断(电泳结果未显示),该结果表明,所提取的DNA数量和质量均适合于PCR扩增。212　标准曲线的建立

在定量检测中标准报告荧光信号(Rn)

因成分的百分含量。

图1　转基因大豆标准品外源

CP4EPSPS基因量扩增结果

213　检测灵敏度

在进行实时荧光PCR定量检测中,检测

灵敏度即所谓的检测低限通常有3种表示方法:绝对检测低限(能被检测和定量到的模板起始拷贝最低数)、相对检测低限(能被检测和定量到的外源基因的最低百分含量)、实际检测低限(实际被检测的DNA数量)。实时

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综述与专题评论

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荧光PCR检测的灵敏度主要取决于以下3

方面:用于PCR反应的DNA总量;被检测作物品种的基因组大小;每个基因组中所含外源基因的数目,即外源基因的拷贝数[8]。

本研究中采用相对检测低限测定转基因大豆Roundup2Ready的检测灵敏度。通过从不同浓度的转基因大豆标准品中提出DNA进行CP4明,转2的CP40101%(见图2)。低标识限量的100倍,已经完全能满足转基因检测的需要。

续表3

转基因成分检测值/010501501052301492101054201501901052801513501004101177351601%210211205118829210672011328136

910

平均值

)

1)

CV//1),标准偏差;2)CV:Coeffi2

ofVariation,变异系数。

　　从表3中可知,转基因成分含量为

0105%、015%和2%的3种样品的测定结果的变异系数分别为017735%、318559%和614233%,其回收率分别为105150%、10217%、103136%,说明此方法具有良好的准确性和重现性。

3　结论与讨论

311　引物和探针的设计

图2　转基因大豆外源CP4EPSPS基因定量

检测灵敏度测定

214　检测精密度

为确证实验的准确性和精确性,本实验选取了转基因成分含量为0105%、015%和2%的3种样品进行了n=10次的测定,并通

过统计分析得到了采用实时荧光PCR检测

方法的精密度(如表3所示)。

表3　转基因大豆定量检测方法精密度

转基因成分检测值/

01050150105110151130104790154900105280148270

10492015053010573015132010612015179010533015235010486015371

%210210124211127118936211513211682213146119843210311

12345678

实时荧光PCR检测中引物和探针的设

计是PCR扩增获得成功的关键之一。在设计引物和探针时应尽量遵循以下原则:引物要在探针确定以后再选择,并尽可能地与探针接近,但不要重叠。保持GC含量在30%～80%之间,但要避免同一碱基重复过多,特别是G,不可超过4个;在引物中3’末端的5个碱基中G和(或)C的总数不能超过2个,在探针中5’末端的第一个碱基不能是G;无论引物还是探针Tm一般应当在58～60℃之间较为合适。

为了能有效检测转基因产品,通过文献研究[9,10],设计采用了引物与探针的最佳组合,使PCR反应效率高,灵敏度高,重现性好。312　检测精确度和灵敏度的测定

定量实验,误差是不可避免的。设立重复实验,对数据进行统计处理,可以将误差降低到最小。本研究中通过重复实验确定了该方法的检测精密度,所测数据经t检验(显著性水平α=0105)分析表明,该方法所测数据合理。

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通过转基因大豆标准品和非转基因大豆

样品的混合,测定了该方法对转基因大豆检测的灵敏度。实验结果表明,转基因大豆实时荧光PCR检测的灵敏度小于0101%。考虑到国际上目前设定的转基因限量是本方法检测灵敏度的100倍,本研究认为0101%的要。

参

献

1　MayerR1FoodControl,1999,10:391～3992　SwissFederalOfficeofPublcHealthDepartmentof

FoodScienceCH23003Bern,Swizerland.Ei2dgenossischeDrucksachenundMaterialzentrale.1995,R817.02.

3　ECRegulation1998/11391Councilregulation

(EC)No1139/98of26May1998Concerningthe

CompulsoryIndicationoftheLabellingofCertainFoodstuffsProducedfromGeneticallyModifiedOr2ganismsofParticularsotherthanThoseProvidedforinD79/112/EEC1Brussels,Belgium1L159:4～7

4　JankiewiczA,BrollH,ZagonJ1Res

,,209:82

5　R1Cell,

,:1～1　Cal1Biotechnology,1993,

11(:1026～1030

7　BarryGF,KishoreGM,PadgetteSetal1

Glyphosate2tolerant52Enolpyruvateshikimate232PhosphateSynthases,U1S1Patent,56270612A9.1997

8　HubnerP,WaiblingerHU,PietschKJ.AOAC

Int,2001,84:1855～1846

9　VaitilingomM,PijnenburgH,GendreFetal,J

AgricFoodChem,1999,47:5261～5266

10　KnutGB,ArneHJ.EurFoodResTechnol,

2001,213:432～438

综述与专题评论

Real2timeQuantitativePolymeraseChainReaction

MethodsforGeneticallyModifiedSoybeanChenYing1　XuBaoliang1　SuNing1

WangYuan2　WangBingwu1　GeYiqiang3

1(ChinaImportandExportCommodityInspectionTechnologyInstitute,Beijing,100025)

2(ChinaAgriculturalUniversity,Beijing,100094)

3(ChinaAgriculturalTechnologyDevelopmentCentral,Beijing,100045)

ABSTRACT　Aquantitativemethodwasdevelopedtodetecttransgenic“Roundup2Ready”soy2bean(Monsanto)byreal2timequantitativePCR1SpecialprimersandprobeswereusedtoamplifytheendogenousgenelectinandexogenousgeneCP4EPSPS1Thedetectionlimitofthismethodwas0101%whichwas100timeslowerthanthelowestinternationallabelingthreshold1Thesta2tisticalanalysisshowedthattheaccuracyandprecisionofthismethodwasinagreementwithoth2erquantitativeGMOdetectionsystems1Keywords　real2timequantitativePCR,“Roundup2Ready”soybean,GMO

detection

信息窗

吃适量的巧克力有助于心脏健康

美国加里福尼亚大学的研究人员指出:富含黄酮醇的巧克力与改善血管功能之间有着某种潜在的联系。从医学角度来讲,血管功能、胆固醇含量及血压都是心血管健康的重要指标。21名健康人参加该实验,他们被随机分为2组,每天分别吃下46g富含黄酮醇(约含259mg黄酮醇)和不含黄酮醇的巧克力。2周后当研究人员化验他们血液中黄酮醇含量时,发现巧克力中的黄酮醇均被吸收到血液中。

黄酮醇对健康有益的研究结果还有以下几点:(1)黄酮醇能放松血管周围的肌肉,使血流顺畅;(2)黄酮醇能维持或增强氮氧化合物在血管功能中的效用;(3)黄酮醇对于血小板(起凝血作用)能产生一种类似于阿斯匹林的效用。研究人员认为,只要量适当,每天吃一些巧克力还是有益于身体健康的。

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