基因工程菌中重组质粒的稳定性研究进展

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生物技术通报
? 综述与专论 ?

ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＢＵＬＬＥＴＩＮ

２００８ 年第 ４ 期

基因工程菌中重组质粒的稳定性研究进展
肖硕
摘 要：

洪华珠

彭建新

（ 华 中 师 范 大 学 昆 虫 学 研 究

所 ， 武 汉 ４３００７９）

基因工程菌 细胞 ）是现代生物工程中的微型生物反应器， 是基因工程的研究主体之一。获得使外源基因 （

高效稳定表达的基因工程菌或细胞是基因工程的核心步骤与最终目的。基因工程菌重组质粒稳定性问题是基因工程菌 影响因素及提高稳定性策略方面作简要介绍并展 工业化生产与实验研究中的最主要问题 ， 就其在基因工程中的重要性、 开综述。 关键词： 基因工程 重组质粒 稳定性 策略

Ｒｅｓｅａｒ ｃｈ Ｐｒ ｏｇｒ ｅｓｓ ｏｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｘｉａｏ Ｓｈｕｏ Ｈｏｎｇ Ｈｕａｚｈｕ Ｐｅｎｇ Ｊｉａｎｘｉｎ
（ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｈｉｎａ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｈａｎ ４３００７９）

Ａｂｓ ｔｒａ ｃｔ ：

Ｒ ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｓ ｓｕｂｍｉｎｉａｔｕｒｅ ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ ｉｎ ｍｏｄｅｒｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ ｏｎｅ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐａｌ ｐａｒｔ ｏｆ

ｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｓｔｅａｄｙ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｉｓ ｔｈｅ ｈａｒｄ ｃｏｒｅ ｓｔｅｐ ａｎｄ ｆｉｎａｌ ａｉｍ． Ｐｌａｓｍｉｄ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｉｓ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｒｏｂｌｅｍ ｏｆ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌｉｚｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｒｅｓｅａｒｃｈ． Ｔｈｅ ａｒｔｉｃｌｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ ａｎｄ Ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ｉｔｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ， ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ， ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ． Ｋｅ ｙ ｗｏｒｄｓ ： Ｇｅｎｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｌａｓｍｉｄ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ Ｓｔｒａｔｅｇｙ

狭 义 的 基 因 工 程 即 重 组 ＤＮＡ 技 术 ， 其 基 本 过 程 主 要 包 括 以 下 的 ５ 个 方 面 ： ｌ） 从 供 体 细 胞 中 分 离 出 基 因 组 ＤＮＡ， 用 限 制 性 核 酸 内 切 酶 分 别 将 外 源

（ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ） 、 酒 酵 母 等 。在 重 组 基 因 工 程 菌 酿 培 养 过 程 中 ， 遇 到 的 主 要 问 题 有 ： ｌ） 有 机 酸 类 代 谢 副 产 物 积 累 并 抑 制 菌 体 生 长 和 产 物 的 表 达 ； ２） 大 规 模 及 高 密 度 培 养 过 程 的 供 氧 限 制 ； ３） 外 源 基 因 高 表 达 引 起 宿 主 细 胞 生 理 负 担 过 重 ； ４） 质 粒 不 稳 定 性 问 题。 中， 质粒的稳定性研究尤为重要， 对于一定结 其 构的基因工程菌而言， 提高质粒的稳定性对于基因 产物的生产及科学研究具有重要意义， 就基因工程 菌中影响质粒稳定性的因素及提高稳定性的策略 展开综述。

ＤＮＡ （ 包 括 外 源 基 因 组 和 目 的 基 因 ） 和 载 体 分 子 切
开 （ 简 称 切 ） ； ２ ） 用 ＤＮＡ 连 接 酶 将 含 有 外 源 基 因 的

ＤＮＡ 片 段 接 到 载 体 分 子 上 ， 形 成 ＤＮＡ 重 组 分 子
（ 简 称 接 ） ； ３ ） 借 助 于 细 胞 转 化 手 段 将 ＤＮＡ 重 组 分 子 导 入 受 体 细 胞 中 （ 简 称 转 ） ； ４） 短 时 间 培 养 转 化 细 胞 ， 以 扩 增 ＤＮＡ 重 组 分 子 或 使 其 整 合 到 受 体 细 胞 的 基 因 组 中 （ 简 称 增 ） ； ５） 筛 选 和 鉴 定 转 化 细 胞 ， 获 得使外源基因高效稳定表达的基因工程菌或细胞 （ 简称检） 。作为现代生物工程的关键技术， 基因工 程的主体战略思想是外源基因的稳定高效表达， 基 因工程菌（ 细胞） 即是现代生物工程中的微型生物 反应器。 用 于 重 组 ＤＮＡ 技 术 中 的 宿 主 细 胞 既 有 原 核 生 物， 又有真核生物， 典型的宿主细胞如： 大肠杆菌

１

质粒不稳定性的定义及类型
重组质粒的不稳定性， 是指重组菌在培养过程

中发生突变或丢失， 结果使重组菌失去了原有的表 型特征。依据重组质粒的变化本质， 质粒不稳定性 可分为结构不稳定性、 离不稳定性。质粒的结构 分 不 稳 定 主 要 是 由 于 ＤＮＡ 的 插 入 、 缺 失 或 重 排 等 引 起的不稳定， 使目的基因功能丢失， 但对质粒主要

收稿日期： ２００７－１２－１７ 作者简介： 肖硕（ １９７４－ ） ， 女， 主管药师， 在读研究生， 研究方向： 农业害虫与生物防治 通讯作者： 洪华珠， 电子信箱： ｈｚｈｏｎｇ＠ｍａｉｌ．ｃｃｎｕ．ｅｄｕ．ｃｎ

１０

生物技术通报 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ

２００８ 年第 ４ 期

遗 传 标 记 丢 失 影 响 较 小 ［１］。 质 粒 的 分 离 不 稳 定 是 细 胞在分裂后分离时引起的不稳定， 由于质粒在子代 细胞中的不均匀分配而使部分细胞不含质粒， 是质 粒丢失的主要原因。 粒的分离不稳定性常出现在 质 两种情况， 一是传代质粒只在许多世代之后才明显 产生丢失 ； 二是带有质粒的细胞与无质粒细胞有 不 同 的 生 长 速 率 导 致 。 外 源 基 因 载 体 ＤＮＡ 的 存 在 犹如细胞内存在多拷贝的质粒一样， 对宿主是一种 代谢负担， 当外源基因大量产生特异蛋白时， 这种 代谢压力就变得更加严重。一般条件下， 带有重组 质粒的宿主菌的生长速率低于无质粒的细菌， 由 此， 质粒的稳定性伴随着生长速率的不同而变化。 基因重组菌的比生长速率对质粒稳定性有很大的 影响， 在连续培养时， 发 现在低比生长速率（ ０．３０２ｈ－１） 下 重 组 质 粒 只 可 以 完 全 维 持 ２０ 代 。 Ｏ’ Ｋｅｎｎｅｄｙ 等 （ １９９５ ） 发 现 ， 在 复 合 培 养 基 和 基 本 培 养 基 中 ， 重 组 酿酒酵母的质粒稳定性和比生长速率的关系不同。 在葡萄糖限制的复合培养基中， 质粒丢失速率随稀 释率的增加而增大， 但是在葡萄糖限制的基本培养 基中则相反 。
［３］ ［２］

低影响质粒稳定性及人类特异性免疫反应的降低 ［７］。

２．３

调控突变、 养条件等 培
外源基因的调控突变、 养条件及质粒中所携 培

带的外源基因性质、 组菌的生长速率、 源基因 重 外 的表达水平等因素都是影响质粒稳定性的因素， 有 些需要在质粒设计和构建时仔细考虑， 有些则与培 养过程有关。

３
３．１

提高质粒稳定性的策略
质粒的选择
为了构建稳定的结构体， 最好利用小的质粒，

小的质粒在高密度发酵中遗传性状比较稳定， 而大 的质粒往往由于发酵环境中各种因素的影响， 而出 现 变 异 的 几 率 较 高 ［３ ， ８］。 Ｋｉｍ 等 报 道 ， 用 穿 梭 质 粒 克 隆 大 肠 杆 菌 ＤＮＡ 片 断 ， 转 化 大 肠 杆 菌 ， 重 组 质 粒 能 稳 定 地 传 代 ； 而 转 化 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ 后 ， 重 组 质 粒 在 传 代 过 程 中 发 生 分 离 ［９］。

３．２

选择合适的插入片段或重新构建表达载体

Ｂｉｏｎ 和 Ｌｕｘｅｎ 报 道 ， 插 入 ＤＮＡ 片 断 的 大 小 ， 在
质粒分离不稳定性中有关系。 们酶切同源和外源 他 染 色 体 ＤＮＡ， 得 到 大 小 不 同 的 片 断 ， 与 穿 梭 质 粒

２
２．１

质粒不稳定性的影响因素
宿主细胞的遗传特性
重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞

ｐｗＢ１１０ 重 组 。 得 到 两 个 重 组 质 粒 ｐＬＢ２ （ ３．６ｋｂ ） 和 ｐＬＢ５ （ ５．９ｋｂ ） ， 转 入 枯 草 杆 菌 后 ， 重 组 质 粒 的 稳 定 性
表 现 出 和 插 入 ＤＮＡ 片 断 大 小 有 关 。 而 转 入 大 肠 杆 菌 ， 重 组 质 粒 却 不 表 现 出 这 种 相 关 性 ［３］。 赵 月 娥 等 对 人 ｔＰＡ 基 因 进 了 重 建 ， 保 留 了 Ｆ 、 和 Ｐ 区 并 引 Ｇ 入 突 变 ， 构 建 了 Ｋ１ ， Ｋ２ 区 缺 失 突 变 的 重 组 ｔＰＡ 质 粒 ｐＱＥ３０ ， 并 在 大 肠 杆 菌 ＪＭ１０９ 菌 株 中 成 功 表 达 。 从 理 论 上 分 析 与 实 验 数 据 均 显 示 ， 由 于 重 建 的 ｔＰＡｒ 基 因 的 ＤＮＡ 长 度 减 少 了 ４０％ ， 克 隆 并 导 入 宿 主 菌 后 ， 具 有 更 高 的 遗 传 稳 定 性 ［１２］。

遗传特性的影响。相对而言， 重组质粒在大肠杆菌 中比较稳定， 在枯草杆菌和酵母中较不稳定， 但是 也 有 例 外 。黄 立 志 等 发 现 外 源 ＮＫ 基 因 的 导 入 对 宿 主 Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１ 与 ｙｅａｓｔ Ｐｉｃｈｉａ ＧＳ１１５ＤＥ 生 长 没 有 明 显 影 响 ， 重 组 质 粒 Ｐｂｖ２２０－ＮＫ 在 大 肠 杆 菌 中 结 构 稳定性有待提高， 而在毕赤酵母中稳定性很好 。
［４］

２．２

质粒的特性
在重组菌细胞中， 质粒载体的大小与拷贝数是

ｐａｒＤＥ 基 因 的 插 入 ， 可 提 高 重 组 质 粒 稳 定 性 。
莫 志 伟 等 将 ｐａｒＤＥ 基 因 插 入 到 ｐＳＴ１０２１ 等 质 粒 上 可以提高重组质粒的遗传稳定性， 提高基因工程菌 的 应 用 效 果 ［１０］。赵 立 平 等 也 利 用 ＲＫ２ 质 粒 的 ｐａｒＤＥ 片段提高重组质粒在生防菌成团泛菌中的稳定 性 ［１１］ 。

影 响 质 粒 分 离 不 稳 定 的 重 要 因 素 。 插 入 ＤＮＡ 片 段 的大小及特性等在质粒分离不稳定性中有关系， 一 般小的片段 质粒比较稳定 。对于松 弛型质粒载体， 一般情况下， 伴随着细胞分裂， 质粒以随机方式分 配到子粒细胞中， 质粒拷贝数越高， 出现无质粒载 体细胞的概率就越低， 质粒就越稳定， 而质粒载体 的寡聚化效应会导致质粒载体拷贝数大大降低， 从 而 加 重 质 粒 的 分 离 不 稳 定 性 ［５ ， ６］。 Ｍｉｃｈｅｌｌｅ Ｅ．Ｇａｈａｎ 等 研 究 发 现 口 腔 减 毒 疫 苗 菌 株 ＢＲＤ 质 粒 拷 贝 数 降
［３］

３．３

选择适当的宿主细胞
重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞

遗传特性的影响。相对而言， 重组质粒在大肠杆菌 中比较稳定， 在枯草杆菌和酵母中较不稳定， 但是

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肖硕等： 基因工程菌中重组质粒的稳定性研究进展

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也 有 例 外 ［４］。 同 一 宿 主 菌 株 对 不 同 质 粒 的 稳 定 性 不 同， 而同一质粒在不同宿主菌株中的稳定性也有差 别。因此对于不同的表达系统、 源基因表达产物 外 的性质、 达产物是否需要进行后加工及其复杂程 表 度将决定宿主菌的选择， 如真核或原核生物、 白 蛋 酶缺陷型或营养缺陷型等的宿主菌。

拌速率适于保存质粒的稳定性。在搅拌罐发酵时， 质粒拷贝数通常比摇瓶培养低， 原因是搅拌罐中有 较好通气， 生长速率较高， 染色体复制增加， 当溶解 氧强度在非选择性培养基中周期变化时， 重组酵母 连续培养质粒稳定性强烈依赖于培养的生长速率， 在较低生长速率下完全稳定， 提高氧压力或增加氧 浓度能引起细胞内氧化性胁迫， 而过渡或稳定阶段 缺 氧 条 件 引 起 氨 基 酸 生 产 和 质 粒 稳 定 性 受 限 制 ［１５］。

３．４

添加选择压力
重组菌的稳定性受遗传及环境因素两方面的

控制， 所以可以通过基因水平的控制来限制反应器 中无质粒细胞的繁殖以提高系统中含质粒细胞的 比例。在重组菌培养过程中通常采用增加“ 择压 选 力” 提高重组菌的稳定性。 选择压力” 常包括： 来 “ 通

３．５．３

温 度 和 ｐＨ

有的质粒属温度敏感型质粒，

如 农 杆 菌 质 粒 ， 当 农 杆 菌 培 养 温 度 超 过 ３０℃， 即 引 起 质 粒 丢 失 ［１６］； Ｋｗａｎｇ Ｈ． Ｓｏｎ 等 也 发 现 培 养 温 度 处 于 ３０℃～ ４４℃时 ， 巨 大 芽 孢 杆 菌 ＰＣＫ１０８ 质 粒 结 构 —— 基 本 稳 定 ， 而 且 其 目 的 产 物 —纤 维 素 酶 产 量 比

１） 在 质 粒 构 建 时 ， 加 入 抗 生 素 抗 性 基 因 ， 在 生 物 反
应器的培养基中 加入抗生素 以 抑 制 无 质 粒 细 胞 （ Ｐ－ ） 的 生 长 和 繁 殖 ； ２） 利 用 营 养 缺 陷 型 细 胞 作 为 宿 主 细 胞， 构建营养缺陷型互补质粒， 设计营养缺陷型培 养 基 抑 制 无 质 粒 细 胞 （ Ｐ－ ） 的 生 长 和 繁 殖 ； ３ ） 噬 菌 体 抑制及转化子中自杀蛋白的表达， 在含“ 择压” 选 的 培 养 基 中 培 养 基 因 工 程 菌 可 以 有 效 地 抑 制 （ Ｐ－ ） 细 胞的生长和繁殖， 提高质粒稳定性。这种方法对于 质粒或宿主细胞本身发生了突变， 虽保留了选择性 标记、 不能表达目的产物的细胞无效。史悦等发 但 现 质 粒 ＰＥＴＮＨＭ 在 无 抗 生 素 选 择 压 力 下 ， 连 续 传 代 ４８ 代 后 质 粒 丢 失 的 无 质 粒 细 胞 开 始 出 现 ， 进 一 步研究表明， 卡拉霉素的选择压力能够保证质粒的 稳定遗传 。
［５］

３０℃时 显 著 提 高 ， 但 ３０℃时 质 粒 稳 定 性 较 强 ［１７］。 对
于温度敏感型质粒， 为了控制在生长前期其外源基 因不表达， 一般采用二阶段温度培养系统， 即在菌 体生长阶段， 采用较低的培养温度， 当菌体生长至 适宜浓度和生长时期时， 提高温度进行诱导， 使外 源基因表达。与一般微生物发酵相似， 重组工程菌 的 生 长 和 产 物 合 成 时 的 ｐＨ 值 往 往 不 同 ， 如 重 组 Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ ｓｕｂｓｐ．Ｌａｃｔｉｓ （ ｐＩＬ２５２ ） 对 生 长 和 质 粒 稳 定 性 的 最 适 ｐＨ 值 分 别 为 ６．３９ 和 ６．４１ ［１８］。

３．５．４ ３．５．４．１

选择合适的培养操作方式 适当采用流加操作方式 不同流加方式

对质粒的稳定性影响也较大。 研究生产重组葡聚 在 糖酶的枯草杆菌质粒稳定性时发现， 周期性分批流 加的酶产量和质粒稳定性高于间歇培养和恒化器 培 养 ， 周 期 ２～ ， 质 粒 稳 定 ； 大 于 ６ｈ ， 质 粒 丢 失 增 ４ｈ 多， 而间歇性培养和恒化器培养时质粒很快丢失 ［１９］。 另外， 选择合适的流加方式可提高质粒在非选择性 培 养 基 中 的 稳 定 性 和 工 程 菌 的 产 量 ［２０］。

３．５ 控 制 培 养 条 件 ３．５．１ 培 养 基 组 成 培 养 基 组 成 成 分 及 其 比 例 对 质 粒 的 稳 定 性 影 响 较 大 ， Ｊｏｎｅｓ 和 Ｍｅｌｌｉｎｇ 研 究 了 连 续 培 养 中 Ｅ．ｃｏｌｉ 中 几 种 质 粒 的 稳 定 性 ， 分 别 以 葡 萄
糖、磷酸盐和无机盐作为限制性基质， 发现除

ｐＢＲ３２５ 外 的 大 部 分 质 粒 在 以 磷 酸 盐 为 限 制 性 基 质
时很快丢失
［１３］

３．５．４．２

连续培养

连续培养的方式很多， 一种选

。 周 宇 荀 等 也 发 现 抗 菌 肽 基 因 Ａｄｅｎｏ
［１４］

择性循环反应器在连续培养过程中采用诱导方法 使含质粒细胞在分离器中絮凝， 而细胞生长和产物 合成在主发酵罐中进行， 循环过程将目的菌株（ 含 质粒菌株） 和非目的菌株（ 不含质粒或杂菌） 分开， 富集重组菌或生产菌， 能使含质粒细胞占优势并能 高速合成外源蛋白。 续培养的稀释速率对质粒稳 连 定 性 有 显 著 影 响 。 对 含 重 组 质 粒 ＰＬＧ６６９－２ 的 酿 酒 酵母研究发现， 稀释速率周期变化时， 周期的振幅

ｒｅｇｕｌｉｎ （ ＡＤＲ ） 培 养 基 中 适 当 加 入 葡 萄 糖 ， 对 质 粒 的
稳定性及蛋白表达量有重要作用 。

３．５．２

氧传递和搅拌

对固定化重组工程菌菌培

养来说， 氧传递受固定化胶粒屏障和胶粒表面高浓 度细胞的限制， 搅拌速率影响着培养液内的氧供应 和对菌体的剪切力， 强烈搅拌使固定化胶粒内细胞 浓度明显减少， 质粒稳定性也显著降低， 温和的搅

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和 频 率 是 质 粒 稳 定 性 的 重 要 参 数 ［２１］。

的效果。 着基因工程及分子生物学技术的进一步 随 发展， 将会从根本上解决基因工程菌中质粒稳定性 的问题， 为外源基因高效稳定表达提供坚实的基 础。
参考文献

３．５．４．３

固定化培养

细胞固定化是在固定化酶

技术的基础上发展起来的， 细胞的固定化方法可以 分为吸附法、 埋法、 联法及共价法等。 于大部 包 交 由 分细胞在固定化后仍可以保持生长繁殖能力， 因 此， 大多数研究工作都集中在吸附法和包埋法。固 定化细胞的主要优点是： 细胞 可以重复或连续使 用， 可以提高生产效率； 另外， 细胞固定化后， 可以 为细胞创造一个适宜的局部环境 （ 如温度、 、 ｐＨ 剪 切力等） ， 有利于细胞的生长和产物表达。 于基因 对 工程菌而言，， 相对于游离细胞悬浮培养， 固定化细 胞培养可以有效克服或减少质粒不稳定现象， 特别 用非选择性培养基时， 固定化细胞培养系统可提高 反应器产率， 得到高细胞浓度和高产物。在固定化 细胞培养体系中， 重组质粒稳定性得到提高， 但其 机 理 还 不 是 很 清 楚 ， 主 要 原 因 可 能 有 ： ｌ） 固 定 化 细 胞 的 生 长 速 率 下 降 ； ２） 细 胞 的 区 域 化 分 布 ； ３） 固 定 化材料的物理结构和化学性质影响质粒稳定性， 使 得质粒 的分离不稳定性得到 改善， 不含质粒细胞 的 生 长 优 势 减 少 ， 使 质 粒 稳 定 性 高 于 游 离 细 胞 培 养 ［６］。 在细胞固定化方法及固定化细胞反应器的研究中， 应该注意尽可能地应用最简单的固定化方法及与 其相匹配的最优生物反应器。中空纤维反应器、 固 定床反应器、 相流化床反应器等就是其中的典型 三 例子， 这些反应器有些己经工业化应用， 有些还处 于实验室或工业化实验研究阶段。

１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５ １６ １７ １８ １９ ２０ ２１

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３９３～４０９．
林 栖 凤 ． 植 物 分 子 育 种 ． 北 京 ： 科 学 出 版 社 ， ２００４ ， ２２３￣２５９．

４

存在的问题及展望
虽然提高质粒稳定性的研究有了很多成功实

Ｋｗａｎｇ Ｈ Ｓｏｎ１ ， Ｊｏｎｇ Ｈ Ｊａｎｇ１ ， Ｊｕｎｇ Ｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ， １９８７ ， ９ ： ８２１￣８２４．
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例， 但因基因工程菌的培养与发酵受诸多因素与条 件的影响， 而且随机性和可变性大， 要在实验条件 下使基因工程菌的质粒保持稳定的遗传性状， 仍存 在各种工程问题有待于解决。 于基因工程菌的多 由 样性， 所采用的手段常缺乏通用性， 研究的特定体 系， 一般要采取具有针对性的措施， 才能获得较好

６７９～６８２．
（ Ａｒｇｙｒｏｐｏｕｌｏｓ Ｄ， Ｌｙｎｃｈ ＨＣ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， １９９７ ， ５６ １） ：

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Ｋｈａｓａｒ Ｓ， Ｐａｕｌ ＦＧ， Ｄａｖｉｄ ＡＭ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １９９６ ，
（ ４５ ３） ２０５～２１０．



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