人EBLN1基因系统进化分析及其生物学功能研究

发布时间：2018-01-31 13:29

本文关键词： EBLN1 基因系统进化分析及其生物学功能研究　出处：《重庆医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景人内源性逆转录病毒(human endogenous retroviruses,HERV)是在病毒感染过程中,其DNA整合到人类基因组并经过长期遗传而产生的。人类基因组中约8%的基因来自于内源性逆转录病毒。HERV参与胚胎发育、免疫调节等多种人体正常生理功能。在分子水平上,HERV可通过多种方式参与基因表达调节,如启动子、增强子或沉默子、多聚腺苷酸化信号、各种核蛋白结合位点。研究表明,HERV的异常表达与人类某些疾病的发生密切相关,主要包括神经精神疾病、癌症和免疫性疾病。如HERV-W1在多种恶性肿瘤中呈高表达和异常活化。因而,深入研究HERV的生物学功能有利于揭示人类疾病的致病机制,HERV有望成为治疗的新靶点。EBLN(endogenous borna-like N elements)与博尔纳病病毒(borna disease virus,BDV)核蛋白(P40)具有高度同源性的内源性非逆转录病毒。迄今为止,在人类基因组中已经发现7个EBLNs,分别命名为EBLN1~EBLN7。其中,EBLN1与BDV N蛋白氨基酸序列的同源性最高。目前人们对EBLN1的生物学功能了解甚少。已证实,EBLN1不仅高表达于293T、MOLT4细胞,而且在少突胶质(oligodendroglia,OL)细胞、神经母细胞(SY5Y)、人胶质瘤细胞(U87)等神经肿瘤细胞中也呈高表达。提示EBLN1可能在维持神经肿瘤的恶性表型中具有重要作用。BDV是一种单股负链RNA病毒,包含6个开放阅读框(open readingframe,orf),至少表达6个病毒蛋白(n、p、x、l、g和m),其中蛋白n(p40)和p(p23)是bdv致病的关键因子。bdv具有高度嗜神经性,主要侵犯边缘系统。动物实验表明,bdv感染可引起宿主行为异常、情绪异常和学习记忆障碍。流行病学调查表明,bdv感染率在精神分裂症、双相情感障碍等神经精神疾病的患者明显高于正常对照组。bdv可能是人类神经精神疾病的致病之一。由此推测,ebln1的生物学功能可能也与神经系统有关。目的1、在完成对5个bdv病毒株(hu-h2、husa1、dessau、cresalo和wr3)全基因组测序的基础上,分析ebln1与人源性bdvn基因的系统进化关系。2、观察rnai技术抑制ebln1后ol细胞、sy5y细胞、u87细胞生物特性的变化,以探讨ebln1在神经肿瘤中的作用。3、观察ebln1蛋白表达对海马神经元的影响及对大鼠学习记忆能力的影响,以探讨ebln1蛋白在神经系统中的生物学功能。方法1、采用rt-pcr技术扩增5个bdv病毒株的全基因组序列;用dnaman软件将5个病毒株全序列与从genbank中获取的bdv全长序列进行同源性比较;用mega软件构建系统进化树。同时进行ebln1与人源性bdvn基因进行同源性比较和系统进化分析。2、构建ebln1干扰慢病毒载体,感染ol细胞、sy5y细胞、u87细胞,分别进行细胞增殖,凋亡、细胞周期、体外克隆、划痕和transwell等实验,以评价ebln1干扰对神经肿瘤细胞生物学特性的影响。qrt-pcr检测ebln1干扰对ol细胞基因表达的影响。westernblotting检测周期和凋亡相关蛋白表达水平。3、构建ebln1表达的慢病毒载体和腺相关病毒载体,分别感染海马神经元和大鼠海马定位注射。免疫荧光检测ebln1蛋白的细胞定位。基因芯片检测ebln1蛋白对神经元基因表达的影响。westernblotting检测突触可塑料性相关蛋白的水平。水迷宫实验评价大鼠的学习记忆能力。结果1、来自不同宿主的5个bdv病毒株(hu-h2、husa1、dessau、cressalo和wr3)的全基因组扩增和测序。进一步分析得出,人源性bdv病毒株与非人源性病毒株之间的同源性为98.07~99.97%;人源性bdv病毒株在亲缘关系上具有地域特征。此外,ebln1与人源性bdvn基因的同源性为47.6%~50.82%,并且与来自德国病人bdvn基因具有紧密的亲缘关系。2、ebln1干扰能够导致ol、sy5y和u87细胞生物特性的改变,分别表现为:ol细胞增殖受抑、凋亡增加,体外克隆形成减少;sy5y细胞运动迁徙能力减低;u87细胞增殖受抑、凋亡增加、体克隆形成减少,同时运动迁徙能力减低。ebln1干扰ol细胞后,3个与胶质细胞瘤的增殖和凋亡密切相关的基因rnd3、osmr和creb3l2呈高表达。ebln1干扰ol细胞后,凋亡抑制蛋白bcl-2的表达明显减低。而bax、caspase3和p53的表达在ebln1干扰前后无明显差异。3、ebln1蛋白定位于胞浆。ebln1蛋白在神经元表达后,检测到有显著表达差异的基因170个,上调基因10个,如nefm、ccdc148、gpr85等;下调基因160个,包括des、abcd5、golga6c、anxa2、parp4等。go富集分析发现,差异基因的功能主要集中在细胞周期、rna转录调控、染色体的固缩和分离等。kegg分析发现,差异基因主要与核糖体信号通路有关。同时,ebln1蛋白可导致神经元突触相关蛋白psd95和perk的表达水平增加。然而,水迷宫实验发现ebln1蛋白表达前后,大鼠的学习记忆能力无明显影响。结论1、人源性bdv病毒株与非人源性bdv病毒株之间具有很高的同源性。bdv病毒在亲缘关系上具有地域性。ebln1与人源性bdv病毒株具有紧密的亲缘关系。2、ebln1干扰能逆转神经肿瘤细胞的恶性表型,提示ebln1在神经肿瘤中具有促癌基因的作用。3、ebln1蛋白可导致突触可塑性相关蛋白和信号通路活化,但其对学习记忆功能的影响尚需进一步研究证实。
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【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R373

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