胃癌血清特征性聚糖谱和差异蛋白筛选及RAGE基因多态性与胃癌发病风险

发布时间：2018-02-01 05:46

本文关键词： 胃癌凝集素芯片特征性聚糖谱凝集素印迹技术胃癌 TMT标记技术生物信息学技术 RAGE sRAGE 胃癌基因多态性　出处：《广西医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分基于凝集素芯片技术的胃癌血清特征性聚糖谱分析目的探讨胃癌患者与健康对照人群血清糖蛋白聚糖谱差异,建立胃癌特征性血清聚糖谱,为进一步寻找胃癌肿瘤标志物及胃癌的诊断提供思路和基础。方法分别收集胃癌患者和健康对照人群血清,采用凝集素芯片技术检测血清蛋白聚糖亲和信号,并应用凝集素印迹技术验证芯片结果的准确性。实验主要包含以下步骤：(1)分别获得健康对照组及胃癌组患者的混合血清并去除混合血清中的白蛋白和IgG；(2)获取的低丰度蛋白经除盐柱转换溶剂体系后采用超滤管提高蛋白浓度；(3)CY5荧光染料标记待测蛋白后与凝集素芯片进行杂交；(4)荧光扫描仪扫描凝集素芯片荧光信号并提取数据；(5)获取的数据采用统计学软件SPSS 13.0进行统计分析。符合正态分布且满足方差齐性检验的数据采用成组设计两样本均数t检验,P0.05视为差异有统计学意义。不满足方差齐性检验的数据采用非参数检验Mann-Whitney秩和检验,P0.05视为差异有统计学意义。(6)凝集素印迹技术检测LEL、PHA-L、RCA-I和STL四种凝集素对血清糖蛋白的亲和能力,验证凝集素芯片结果的可靠性。结果本实验共筛选出13种与肿瘤相关的差异凝集素；其中CAL(识别黏蛋白T/Tn抗原)、DSA(识别三、四天线结构)、EEL(识别半乳糖(α-1,3)半乳糖结构)、LEL(识别N-乙酰氨基葡糖低聚物结构)、PWA(识别(GlcNAcβ4) n结构)、PHA-L(识别p-1,6分支结构)、RCA-I(识别末端Gal β1-4 GlcNAcβ1结构)、RCA-Ⅱ(识别N-乙酰半乳糖胺)、STL(识别N-乙酰氨基葡糖低聚物结构)、UEA(识别αα连接岩藻糖残基)和VAL(识别p-D-半乳糖残基)共11种凝集素在胃癌组中对血清糖蛋白亲和力显著高于健康对照组(P0.05)；而CFL(识别N-乙酰半乳糖胺)和GNL(识别α-1,3甘露糖残基)两种凝集素在胃癌组中亲和信号显著低于健康对照组(P0.05)。凝集素印迹技术证明PHA-L、RCA-I和STL四种凝集素的结果与凝集素芯片结果一致。结论应用凝集素芯片技术成功筛选出13种与血清糖蛋白亲和力存在差异的凝集素,建立了胃癌血清糖蛋白特征性聚糖谱,提示血清糖蛋白特征性糖链改变与胃癌的发生密切相关,为进一步寻找胃癌肿瘤标志物及胃癌的诊断提供思路和基础。第二部分基于TMT技术的胃癌血清定量蛋白质组学分析目的探讨胃癌患者与健康对照人群血清中蛋白差异,并对差异蛋白进行筛选,为寻找胃癌血清肿瘤标志物提供基础。方法胃癌组和健康对照组每组各取10例血清样品混合,混合血清样品去除白蛋白和IgG后,经PD-10脱盐柱除盐。胰酶消化后的肽段进行TMT同位素标记。TMT标记的混合肽段先采用高pH反相液相色谱分离,然后进行低pH nano-HPLC-MS/MS分析。根据质谱鉴定的肽段TMT相对定量值,筛选出表达增加1.2倍或减低0.8倍的差异蛋白；采用生物信息学分析技术对差异蛋白进行筛选。结果胃癌组和健康对照组共鉴定出非冗余蛋白594种蛋白,其中筛选出差异蛋白105种。与健康对照组相比,胃癌组中共48种蛋白表达上调,57种蛋白表达下调。采用生物信息学相关工具对差异蛋白进行解析后发现,差异蛋白主要集中分布在细胞外泌体、细胞外区、细胞外空间、质膜和细胞质；生物学过程集中在介导抗原的结合、钙离子结合、蛋白二聚体活化等；分子功能分类主要负责天然免疫、凝血、细胞代谢过程、受体介导的内吞等。结论本研究采用TMT定量蛋白质组学技术分析胃癌患者血清和健康对照人群血清,筛选出胃癌血清的差异蛋白表达谱,获得一批潜在的胃癌血清标志物,为胃癌的诊断和药物干预治疗提供了潜在的靶点。第三部分sRAGE血清水平和RAGE基因多态性与胃癌发病风险目的检测RAGE基因rs2070600、rs 184003、rs 1800624和rs1800625四个位点的单核苷酸多态性,并联合血清sRAGE水平,探讨广西地区人群RAGE基因突变与胃癌的发病风险的相关性。方法本研究共纳入200例胃癌患者和207例健康体检者,采用PCR-RFLP技术检测RAGE基因rs2070600、rs 184003、rs1800624和rs1800625四个位点的单核苷酸多态性,并对PCR产物进行DNA测序验证基因型的准确性。ELISA法直接检测血清sRAGE水平。哈-温平衡检验纳入的研究对象是否具有群体代表性。采用二元logistic回归分析方法校正性别、年龄、种族、BMI、家族史、吸烟和饮酒等混杂因素,计算比值比和95%可信区间,分析血清sRAGE水平和RAGE基因多态性与胃癌发病风险的相关性。结果1.rs2070600位点和rs184003位点的基因型分布符合哈-温平衡定律(P值均大于0.05),表明研究对象具有较好的群体代表性。2.rs2070600位点有GG.AG和AA共三种基因型,AG基因型可显著增加胃癌的发病风险,其OR=1.62,95%CI=1.03-2.58,P=0.038.联合AG+AA基因型(显性模型)与胃癌的发病风险相关(OR=1.83,95%CI= 1.01-2.39,P=0.0441.AA基因型和G等位基因与胃癌的发病风险无相关性(P值大于0.05)。上述结果提示RAGE基因rs2070600位点基因突变增加胃癌的发病风险。3.rs184003位点有GG.GT和TT共3种基因型,GT基因型与胃癌的发病风险相关,其OR=0.62,95%CI=0-39-0.99,P=0.048.TT基因型、GT+TT联合基因型、GT+GG联合基因型与胃癌的发病风险无相关性(P值均大于0.05)。上述结果提示rs184003位点基因突变降低胃癌的发病风险。4.rs1800624位点有TT.AT和AA共3种基因型, AT基因型、AA基因型、AA+AT联合基因型、AT+TT联合基因型和A等位基因与胃癌的发病风险无相关性(P值均大于0.05)。5.rs1 800625位点有CC.CT和TT共3种基因型,CT基因型、TT基因型、CC+CT联合基因型、TT+CT联合基因型和T等位基因与胃癌的发病风险无相关性(P值大于0.05)。6.不吸烟人群RAGE基因rs2070600位点的AG基因型与胃癌的发病风险相关,其OR=1.71,95%CI=1.01-2.91,P=0.043.不饮酒人群RAGE基因rs2070600位点的AG基因型与胃癌的发病风险相关,其OR=1.75, 95%CI=1.03-2.97,P=0.037.7.rs2070600位点AG基因型血清sRAGE浓度显著低于健康对照组和胃癌组GG基因型血清sRAGE浓度,差异有统计学意义。rs184003位点TT基因型sRAGE水平显著高于健康对照组和胃癌组GG基因型sRAGE水平,差异有统计学意义；rs1800624位点与rs1800625位点各基因型其血清sRAGE浓度之间差异均无统计学意义(P值均大于0.05)。结论RAGE基因rs2070600位点和rs184003位点突变与广西地区人群胃癌的发病风险相关。rs2070600位点突变与sRAGE血清浓度负相关并增加胃癌的发病风险。rs184003突变与sRAGE血清浓度正相关并降低胃癌发病风险
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【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

【参考文献】