水稻MGD同源基因的克隆及功能研究

发布时间：2018-02-02 10:26

本文关键词： 水稻 MGD 转基因烟草低磷胁迫脂质重塑　出处：《西北农林科技大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：高等植物中,单半乳糖甘油二酯(MGDG)和双半乳糖甘油二酯(DGDG)是组成叶绿体中光合膜的主要膜脂类型,其中MGDG是DGDG合成的前体,因而MGDG的合成在植物的正常生长发育中发挥着至关重要的作用。单半乳糖甘油二酯合成酶(MGD)是合成MGDG的关键酶。目前对MGD的研究多集中在双子叶植物尤其是模式植物拟南芥,而对单子叶植物中MGD的类型和功能研究相对较少。为了研究单子叶植物中MGD的类型以及功能,本研究以单子叶模式植物粳稻品种日本晴为研究材料,通过RACE法分离并克隆出三个OsMGD基因,通过生物信息学软件对OsMGD同源基因的类型、亚细胞定位以及功能进行初步预测分析,并构建过表达载体转入烟草来研究水稻MGD同源基因在植株生长以及低磷胁迫下的功能和作用机制。主要获得以下结果:(1)通过NCBI数据库中在线工具Blast,利用拟南芥以及籼稻中的MGD基因序列,在粳稻品种日本晴中,共Blast到三个MGD基因的部分序列,通过RACE法分离并克隆这三个OsMGD基因,分别为OsMGD/02g、OsMGD/08g、OsMGD/09g。通过对多种植物中MGD氨基酸序列进行比对,并构建系统进化树,发现OsMGD/02g与拟南芥MGD2和MGD3在同一进化分枝,则OsMGD/02g初步预测为Type B型MGD;OsMGD/09g则与拟南芥MGD1在同一进化分枝,初步预测为Type A型MGD;而OsMGD/08g隶属另一进化分枝,与上述两种Type类型的进化距离较远,且此进化分枝中均为单子叶植物MGD,因此初步推测OsMGD/08g隶属于单子叶植物特有的新类型MGD。另外通过生物信息学软件分别对三个OsMGD的跨膜结构、亚细胞定位以及启动子区顺式作用元件进行预测分析,发现这三个OsMGD蛋白都是亲水性蛋白,且均不含有跨膜区域,OsMGD/02g和OsMGD/09g定位于叶绿体,而OsMGD/08g定位于线粒体。分析这三个OsMGD基因启动子顺式作用元件发现这三个基因启动子区均存在与逆境胁迫相关的顺式作用元件。(2)利用半定量RT-PCR分别检测三个OsMGD基因在不同水稻组织中的表达,发现OsMGD/02g和Os MGD/09g均在叶和茎中表达量较高,在根和花中表达量较低;而OsMGD/08g则是在叶、根、茎、花中的表达量都很低。随后对这三个基因在低磷胁迫、干旱胁迫以及盐胁迫下叶和根中的表达量进行检测,发现无论在低磷胁迫、干旱胁迫还是盐胁迫时,叶中OsMGD/02g表达量都是先升高后降低,根中OsMGD/02g的表达量则是持续升高;而OsMGD/08g只有在低磷胁迫时会强烈诱导表达;在水稻叶中,OsMGD/09g在不同的胁迫下表达量变化不同,而在水稻根中,OsMGD/09g的表达并不受这三种胁迫影响。通过对三个OsMGD在不同组织以及不同逆境胁迫下的表达模式分析,初步证实系统进化树对这三个OsMGD的Type分类。(3)利用Gateway法构建三个OsMGD基因的植物表达载体,并通过叶盘法完成烟草转化工作。通过潮霉素的筛选,转基因烟草幼苗基因组DNA的PCR检测,以及定量qRT-PCR检测目的基因的表达,各筛选3个转基因烟草株系,结合野生型烟草进行盆栽实验对转基因烟草进行表型分析。在正常条件下与野生型烟草相比,不同OsMGD基因超表达均提高了烟草中的叶绿素含量和类胡萝卜素含量,增强了净光合速率,进而增加了转基因烟草的生长速率,提高了烟草的叶鲜重,从而使得转OsMGD烟草的长势较好。(4)为了研究OsMGD同源基因在低磷胁迫下的功能和作用机制,通过盆栽实验,对转基因和野生型烟草进行低磷胁迫处理。与野生型烟草相比,低磷处理后三个OsMGD基因超表达烟草老叶上的坏死斑明显较少且没有野生型烟草坏死斑严重,而且转基因烟草在低磷胁迫下的叶绿素含量、净光合速率均显著高于野生型烟草,叶绿素荧光参数Fv/Fm、ΦPSII以及ETR在转基因烟草中的下降幅度相较与野生型SR1较小,说明OsMGD同源基因超表达后缓解了低磷胁迫对烟草植株的伤害,转基因烟草的耐低磷能力提高。(5)利用气相色谱对低磷胁迫下烟草老叶中脂质组分进行测定,发现低磷处理后,与野生型烟草相比,转基因烟草中MGDG含量均显著高于野生型SR1,且转基因烟草中DGDG的上升幅度更大,说明低磷胁迫下,OsMGD同源基因超表达烟草中增强了MGDG和DGDG的合成。本研究中低磷处理后野生型烟草和转基因烟草中的磷脂含量均显著降低,但在低磷胁迫下,相对于野生型SR1,转基因烟草中磷脂的下降幅度更小。另外,计算GL/PL以及DGDG/MGDG的比值后发现,超表达OsMGD同源基因烟草在低磷胁迫下具有较高的GL/PL和DGDG/MGDG,表明有更多的可以形成双层膜的DGDG转移到质体外膜来替代缺失的磷脂,从而维持膜的完整性和稳定性。因此,通过调控半乳糖脂的合成能力加强了低磷胁迫下的脂质重塑,然后维持膜结构的完整以及稳定,进而维持叶绿体以及其他亚细胞器的结构和功能,缓解低磷胁迫对植物造成的伤害,从而提高植物对低磷胁迫的抗性。(6)通过比较OsMGD/02g、OsMGD/08g以及OsMGD/09g基因超表达烟草在低磷胁迫下的生理指标以及脂质组分变化,发现转OsMGD/08g基因烟草对低磷胁迫的耐受性更强,其次是转OsMGD/02g基因烟草。OsMGD/08g可能是在长时间低磷胁迫时发挥作用,且很可能是低磷胁迫诱导OsMGD/08g基因表达后直接在线粒体膜上利用磷脂降解代谢物二酰基甘油酯(DAG)作为底物催化合成MGDG,并通过线粒体上可能存在的双半乳糖甘油二酯合成酶(DGD)合成DGDG,直接在线粒体膜上替代减少的磷酯,从而维持膜的完整性和稳定性。而预测为Type B型的OsMGD/02g则主要是在短期低磷胁迫下表达,在长时间低磷胁迫时表达相对减弱。
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【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2

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