通过外源MYB基因的表达提高水稻的抗逆性

发布时间：2018-02-04 12:21

本文关键词： Am Rosea1基因转录组分析胁迫耐受性程序化细胞死亡 OsZOU　出处：《山东师范大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：MYB基因家族是植物中数量最多的一类转录调控因子,R2R3-MYB基因是MYB基因家族中最大的一个亚家族。R2R3-MYB基因不仅参与植物的发育及代谢过程,同时还在生物胁迫以及非生物胁迫耐性中发挥重要作用。Am ROSEA1属于R2R3-MYB蛋白,是调节金鱼草花色素分布及密度的关键因子。Am Rosea1之前被引入烟草、番茄、矮牵牛以及棉花等多个双子叶物种中,并且显著提高了转基因植株花青素或其他次级代谢物的含量。为了研究Am Rosea1异位表达对于水稻生长发育的影响,我们将Am Rosea1转入日本晴水稻,检测了转基因水稻中花青素以及类黄酮的含量,并进行了高盐胁迫以及干旱胁迫实验。我们发现,外源Am Rosea1基因能够显著提高转基因水稻对于高盐胁迫以及干旱胁迫的耐性。我们对野生型水稻以及转基因水稻在正常生长环境以及高盐或干旱胁迫条件下的转录组进行了测序分析,发现一系列和胁迫相关的基因的转录水平受到了外源Am Rosea1的影响。这些受影响的基因涉及胁迫信号转导、激素信号通路、离子平衡以及活性氧的清除。实验结果如下:1、获得过量表达Am Rosea1的转基因水稻植株我们构建了35S启动子启动Am Rosea1过量表达的表达载体,并将其转入水稻栽培品种日本晴中。利用Am Rosea1特定的引物,对抗性苗进行PCR验证,共有24棵PCR阳性植株。半定量实验证明OXR20,OXR21和OXR22三个植株中Am Rosea1的表达量较高。2、测量花青素和总类黄酮的含量为检测Am Rosea1的过量表达对水稻花青素和总类黄酮积累量的影响,我们用分光光度法测量了成熟种子、三叶期以及抽穗期叶子中的含量,发现Am Rosea1的过量表达并没有影响转基因水稻植株中花青素和总类黄酮的含量。3、检测转基因植株对于高盐和干旱胁迫的耐性经干旱胁迫处理之后,OXR20、OXR21和OXR22的存活率分别为78%±5.6%,85%±8.2%和80%±7.1%,均高于WT植株20.8%±1.7%的存活率;高盐胁迫处理之后,OXR20、OXR21和OXR22的存活率分别为70%±5.9%、75%±5.6%和69%±4.3%,WT植株全部死亡。这些结果表明:过量表达Am ROSEA1基因显著提高了转基因水稻植株对于干旱和高盐胁迫的耐性。4、转录组分析为了研究转基因株系胁迫耐性的分子机制,我们将OXR21作为转基因株系的代表。取OXR21和WT在胁迫处理前以及胁迫处理不同时间点的叶片,进行转录组测序。筛选与胁迫响应相关的,在OXR21和WT之间差异表达的基因,结果如下:与WT相比,在PEG处理的0 h、6 h和24 h,OXR21中分别有64、282和50个干旱胁迫响应基因表达上调,49、240和33个干旱胁迫响应基因表达下调;在盐处理的0 h、1 h和6 h,OXR21中分别有49、197和58个盐胁迫响应基因表达上调,34、266和26个盐胁迫响应基因表达下调。对差异表达基因的venn分析表明:分别有8个和12个基因在PEG处理的0 h、6 h、24 h三个时间点和盐处理的0 h、1 h、6 h三个时间点的表达都上调;分别有20个基因在PEG处理的6 h、24 h和盐处理的1 h、6 h的表达上调;分别有15和26个基因在PEG处理的24 h和盐处理的6 h的表达上调。对差异表达基因的GO富集分析表明,在“生物学过程”这一类别里,干旱胁迫和盐胁迫的差异基因分别富集到6个GO term里,其中有4个是相同,它们是“对内源性刺激响应”“对非生物刺激响应”“对胁迫响应”和“对刺激响应”。KEGG分析表明,无论是在干旱胁迫条件下还是在盐胁迫条件下,与WT植株相比,转基因植株中的茉莉酸信号通路均被促进,而乙烯信号通路均被抑制。差异表达的基因里包含有钾离子高亲和运输蛋白、果糖基转移酶等与渗透保护相关的蛋白的编码基因,以及过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶(APX)等与氧化胁迫相关的蛋白的编码基因。另外,RD22、热激蛋白、LEA蛋白和RAB16A,这些胁迫响应蛋白;转录因子DREB1F、MYB48和NAC134;信号转导分子,丝氨酸-苏氨酸激酶、CIPK14、CIPK15的编码基因的转录水平,在WT和转基因植株之间也表现出差异。另外,还有一些不知功能的基因的表达被改变。总之,Am ROSEA1在水稻中过量表达通过直接或间接地改变一系列基因的表达水平,使得转基因水稻植株获得了较WT高的盐胁迫耐性和干旱胁迫耐性。被子植物的胚乳由受精极核发育而来,为胚胎的发育提供一些信号。胚乳在种子发育的早期,为胚胎提供营养;在有永久胚乳的种子中,胚乳还为萌发时的幼苗提供营养。谷类种子的胚乳不仅是地球上人类和牲畜最重要的粮食资源,同时能为加工商品和生物燃料提供原材料。因此,研究胚乳的发育不仅具有重要的理论意义,还能产生经济效益。大多数被子植物的胚乳发育类型为核型,发育过程经历:合胞体期,细胞化,内层淀粉胚乳和外层糊粉层胚乳的分化以及细胞的程序化死亡。目前,对于胚乳早期发育的研究已经有了很大进展,但对于胚乳细胞死亡过程的研究仍十分有限。At ZOU基因编码的b HLH转录因子是调节拟南芥胚乳程序化细胞死亡的重要因子。作为重要粮食作物和单子叶模式植物的水稻,其种子中保留有永久性的淀粉胚乳。为研究水稻中ZOU同源基因在水稻胚乳发育以及胚胎发育中的功能,更好地认识水稻胚乳降解的调控机制,我们克隆了水稻中ZOU的同源基因,进行了基因表达分析,功能互补试验,构建了GUS报告载体、正义表达载体、反义表达载体并转化水稻。实验结果表明:1、水稻ZOU基因的进化与表达分析通过序列比对和进化分析,我们发现水稻中存在两个ZOU同源基因:LOC_Os04g35010(Os ZOU-1)和LOC_Os02g34320(Os ZOU-2)。通过实时荧光定量PCR检测它们在营养生长期水稻的根、茎、叶、拔节孕穗期的小花、花后2天、5天、7天以及9天的种子中的表达水平。发现Os ZOU-1在营养器官以及受精前的种子中表达量极低,在DAP2的种子中轻微表达,DAP5时表达量很高,之后降低。Os ZOU-2主要在茎和叶中表达,在种子中表达量极低。2、Os ZOU-1基因互补拟南芥zou-4突变体表型转化At ZOUpromoter::Os ZOU-1的拟南芥zou-4突变体的表型得到部分回复;转化At ZOUpromoter::Os ZOU-2未能改变zou-4突变体的表型。3、通过GUS染色检测Os ZOU-1在种子中的表达模式用报告载体Os ZOU-1promoter::GUS转化水稻,我们发现,在受精后3天的种子上没有GUS信号;受精后5天的种子整个胚乳区都有GUS信号;之后GUS信号的范围逐渐缩小至种子的背部区域。4、Os ZOU-1组成性表达水稻植株的表型用组成性过量表达的载体Ubipromoter::Os ZOU-1转化水稻,转化株系表现出与At ZOU组成性过表的拟南芥株系(zou-1D)相似的表型:植株矮小,叶片窄且沿叶边缘向上卷曲,育性降低。另外我们还发现:组成性过表株系的颖壳细胞变小导致颖壳变窄进而导致种子窄;淀粉胚乳积累不充分,不能完全充满整个果皮。5、Os ZOU-1表达沉默的水稻植株的表型用反义载体ZOUpromoter::Os ZOU-1anti-sense转化水稻植株,转基因种子未能正常进行PCD,胚胎同胚乳粘连在一起;沉默株系种子的生长停滞在大约受精后第8天;淀粉积累明显较WT少。上述结果证明:Os ZOU-1在水稻胚乳发育中起到了调控水稻胚乳程序性细胞死亡的作用。Os ZOU-1过量表达以及Os ZOU-1表达沉默的种子中,淀粉积累均不足,我们推测胚乳程序性细胞死亡影响淀粉的积累。本研究的创新点:本研究首次将Am Rosea1基因导入到水稻(Oryza sativa L.)中。异位表达的Am ROSEA1通过直接或间接地调节不同基因的表达,提高了转基因水稻对高盐和干旱胁迫的耐受,这为利用该基因提高其他水稻品种的非生物胁迫耐受提供了一条可能的途径。本研究首次报道了Os ZOU基因在调控水稻胚乳程序性细胞死亡中的功能,以及PCD异常的水稻种子中淀粉胚乳的积累情况,有助于我们更好地认识水稻种子发育过程中,胚乳细胞程序性死亡的调节机制以及营养物质代谢同结构发育之间的关系。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：Q943.2;S511

【相似文献】