基于假基因内插入的嵌合肠毒素重组减毒大肠杆菌口服疫苗候选菌株的研究

发布时间：2018-02-08 22:04

本文关键词： 大肠杆菌假基因口服疫苗小鼠猪　出处：《东北农业大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是一种主要危害新生仔猪的急性传染病,主要通过黏附素和肠毒素引起仔猪剧烈腹泻。腹泻的仔猪往往因没得到有效预防而死亡,从而给畜牧业生产造成巨大的经济损失。流行病学调查结果显示:ETEC的耐药性在不断提高,而其黏附素的检出率却在下降,所以继续使用传统药物以及针对黏附素的疫苗进行防治已不合时宜,需要一种有效的疫苗尽快出现。为明确嵌合基因在具有天然佐剂功能的不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin-1,LT-1)骨架上的插入位置,先制备了一株针对LT-1,具有中和活性的特异性单克隆抗体,该单抗能有效的阻断LT-1毒素与GM1受体的结合。通过生物信息学软件ABCpred预测,然后用单抗对LTB进行分段筛选,鉴定出与GM1受体结合的肽段MBP-LTB-7(61QKKAIERMKDTLRITY76)。以此为依据,在不影响段肽MBP-LTB-7结构的位置插入外源基因。本研究以大肠杆菌K12基因序列为参照,使用在线服务软件ABCpred预测出6个可插入外源基因的假基因位置,分别是yaiT、yai X、yge O和yge Q、wbb L、ins N、eaeH+和ykg A。进一步经PCR鉴定发现我们分离并改造的野生E.coli O142:△STa菌株中yai T和yai X两个假基因位置可作为携带外源基因的插入点。分别以假基因yai T和yai X为模板扩增出假基因yai T和yaiX的左右同源臂,连入pDOC-K质粒上,构建PRPL-Kil双向筛选平台,然后将平台质粒与p ACBSCE质粒共转化减毒E.coli O142:△STa中。经L-阿拉伯糖诱导使其中的pACBSCE质粒表达I-Sce I切割酶和Red重组酶,含有假基因yaiT和yai X同源臂的PRPL-Kil操纵子分别被切下后与E.coli O142:△STa中的yaiT和yai X假基因位置发生同源重组,构建成O142(yai T::PRPL-Kil)和O142(yai X::PRPL-Kil)两株双向筛选平台。经鉴定当温度升高到43°C时平台中温敏开关打开,kill基因可杀死菌体起到反向筛选效果,表明平台具有相应生物活性。通过SOE-PCR构建嵌合类毒素基因,先将致弱的STaA13Q连在致弱的LTR192G操纵子B亚基后端,再利用SOE-PCR的方法将STb和LT天然转录终止子连到LT192-STa13后,获得LT192-STa13-STb操纵子。将LTA分为LTA1和LTA2两段,再将STa13-STb从LT192-STa13-STb上克隆下来,与LTA1相连获得LTA1-(STa13-STb),最后再将LTA2-LTB-STa13-STb与其进行组装获嵌合基因LTA1-(STa-STb)-LTA2-LTB-(STa-STb)操纵子。在其两端分别连上假基因yaiT和yai X的左右同源臂,构建pDOC-C同源重组系统,按照建立平台时的方法,用LTA1-(STa-STb)-LTA2-LTB-(STa-STb)操纵子去替换插在不同假基因位置上的双向筛选平台,得到重组E.coli ER-T和ER-X。通过毒性检测、消化道环境模拟实验、口服安全性检测、生长曲线测定、遗传稳定性实验、菌毛生长能力鉴定、及肠道定植能力测定,结果显示:重组E.coli ER-T和ER-X安全、稳定,可在肠道定植。进一步以重组E.coli ER-T和ER-X对BALB/c小鼠进行口服免疫,检测各时间点小鼠特异性Ig G及Ig A抗体水平,结果显示:实验组小鼠首次免疫后7-21d,在其血清中均可检测到抗LTA(P0.05)、LTB(P0.05)、STa(P0.05)、STb(P0.05)、F41(P0.05)的IgG抗体。各实验组小鼠免疫后7-28d在其粪便中可检测出抗LTA(P0.05)、LTB(P0.05)、STa(P0.05)、STb(P0.05)、F41(P0.05)的Ig A抗体。首次免疫后42d在小鼠乳汁、脾脏、肠黏液、肠系膜淋巴结中仍能检测到抗LTA(P0.05)、LTB(P0.05)、STa(P0.05)、STb(P0.05)、F41(P0.05)的Ig G和Ig A抗体;在细胞增殖实验中,实验组脾细胞经STa毒素、LT192-STa13重组蛋白、STb毒素、LT192-STb重组蛋白、LT毒素刺激后增殖效果明显好于对照组(P0.05);各组脾细胞培养上清液中的细胞因子IFN-γ和IL-4检测结果显示:免疫组小鼠IFN-γ水平有所上升但没有IL-4上升明显。体外中和实验和体内中和试验结果显示:口服免疫后的小鼠血清、脾细胞裂解液、肠粘液、肠系膜淋巴细胞裂解液对肠毒素具有中和作用。乳鼠攻毒保护试验结果显示:获得母源抗体的乳鼠具有抵抗肠毒素侵袭的能力。重组E.coli ER-T和ER-X免疫仔猪和妊娠母猪后进行Ig G及Ig A抗体检测、细胞增殖实验、细胞因子检测、体内中和以及体外中和实验所得结果的趋势与小鼠基本相似。攻毒保护实验中,免疫组肠绒毛的各项检测数据优于对照组仔猪,两者差异显著(P0.05),表明免疫后仔猪可以抵抗肠毒素攻击。本研究为增强大肠杆菌重组活载体疫苗的免疫效果,通过表位筛选确定了LT1与GM1受体的结合域,构建了可以稳定表达嵌合肠毒素基因的重组减毒E.coli ER-A和ER-B,探索了不同假基因携带外源基因的差异,为重组减毒大肠杆菌口服疫苗研究提供了科学的实验依据。
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【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S852.4

【参考文献】