家蚕防御球孢白僵菌感染相关免疫基因的研究

发布时间：2018-02-11 13:28

  本文关键词： 家蚕 球孢白僵菌 基因 抑菌作用 抗菌肽 蛋白质组　出处：《江苏科技大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是家蚕(Bombyx mori)的重要病原真菌,其所引起的白僵病是全球范围内较为常见的一类真菌病,常对蚕业生产造成重大危害。但是目前包括白僵病在内的家蚕疾病都缺乏有效的治疗手段,所以疾病的预防显得至关重要。但是人们对家蚕响应球孢白僵菌侵染的分子机制仍然知之甚少。本研究通过家蚕体表接种球孢白僵菌,检测了家蚕感染球孢白僵菌后BmcecA、Bmgloverin2和BmLeb5三个免疫基因的表达模式,利用生物信息学工具和分子生物学实验技术克隆三个免疫基因并分析其序列特征和生物学功能,实验验证它们在球孢白僵菌感染免疫应答过程中的功能和作用,并且在蛋白水平上检测了家蚕感染球孢白僵菌后表达差异的蛋白。以家蚕p50为实验材料,利用RT-PCR技术克隆出BmCecA基因的开放阅读框,该ORF编码63个氨基酸,包含22个氨基酸的信号肽和37个氨基酸的成熟肽,通过蛋白结构分析该成熟肽形成经典的双亲α螺旋。实时荧光定量PCR表明,BmCecA在5龄家蚕的体壁、马氏管、中肠、丝腺、血淋巴和脂肪体中均有表达,在脂肪体中表达量最高,其次是血淋巴。在被球孢白僵菌诱导后,3龄蚕中该基因上调表达显著,在36 hpi上调最高;在5龄家蚕中,BmCecA在脂肪体和血细胞中被显著诱导上调表达。本研究构建了原核表达载体pET-30a(+)-CecA,通过Western blot分析表明成功表达了BmCecA蛋白,该重组蛋白在体外对球孢白僵菌有明显的抑菌活性。在证明了表达的BmCecA对球孢白僵菌抑菌作用的基础上,为获得足够量的BmCecA蛋白进行家蚕体内抑菌试验,通过固相合成法合成了BmCecA成熟肽,用质谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明其分子量约为4.07 kDa,高效液相色谱检测其纯度为93.7%。体内和体外抑菌实验均表明家蚕BmCecA对球孢白僵菌有较高的抗菌活性。qRT-PCR结果表明,在3龄蚕感染球孢白僵菌的不同时间点Bmgloverin2均有上调表达,尤其是在接种白僵菌42 h后,Bmgloverin2 mRNA的差异表达倍数最大;同时Bmgloverin2 mRNA在家蚕幼虫的脂肪体中被诱导表达差异显著,从12 hpi开始,感染组的Bmgloverin2 mRNA相对于对照组,一直是持续上调表达的。采用RT-PCR技术克隆出Bmgloverin2基因,将去掉信号肽的Bmgloverin2连接到pCzn1表达载体进行重组表达。SDS-PAGE检测了其表达的正确性,用纯化的Bmgloverin2蛋白制备了多克隆抗体。用Western blot在诱导的家蚕脂肪体里能显著检测到Bmgloverin2蛋白。在BmCecA蛋白溶液中添加Bmgloverin2蛋白,在家蚕体外试验中能显著的降低BmCecA的最小抑菌浓度,在体内试验中能显著的延长家蚕的致死中时间,证明了Bmgloverin2具有协同BmCecA抑菌的作用。通过RACE方法获得了家蚕BmLeb5的cDNA的全长,该cDNA全长为808 bp,包含一个39 bp的5’-UTR、540 bp的开放阅读框和一个229 bp 3’的UTR,该ORF编码179个氨基酸,包含一个20个氨基酸的信号肽,含有4个RXXR基元。生物信息分析结果显示其成熟肽的15位氨基酸残基被O-糖基化。同源性比对显示BmLeb5与家蚕BmLeb3同源性最高,进化树分析说明lebocins在家蚕中是一个多基因家族。首次成功体外表达和纯化了BmLeb5的重组蛋白,并且用液质联用和肽指纹图谱证实了表达的蛋白。对BmLeb5的mRNA的组织表达特异性和对感染球孢白僵菌的响应进行了研究,发现在五龄三天的家蚕中,BmLeb5在脂肪体中表达水平最高,其次是体壁和丝腺,虽然在血淋巴、马氏管、中肠中也能检测得到,但是相对表达量很少;qRT-PCR结果也显示,在家蚕被球孢白僵菌侵染后,BmLeb5在三龄整蚕、五龄脂肪体和血淋巴中均被显著诱导上调表达;说明BmLeb5可能在家蚕抵御球孢白僵菌的过程中起到重要作用。在被球孢白僵菌感染36 h后,取家蚕血淋巴和未感染幼虫血淋巴做Label free非标记蛋白定量分析,共鉴定到671个蛋白,筛选出87个差异蛋白,其中相对于未感染球孢白僵菌的对照组,感染组上调的蛋白质有36个,感染组下调的蛋白质有40个,只在感染组检测到的蛋白质有6个,只在对照组中检测到的蛋白质有5个,在显著上调表达的36个蛋白质中,包括丝氨酸蛋白酶、热激蛋白70、溶菌酶、抗细菌肽、天蚕素B、贮存蛋白、攻击素等可能与免疫反应相关的蛋白质。通过KEGG数据库比对注释,这些差异蛋白质在抵御球孢白僵菌侵染中主要参与了阿米巴病、MAPK信号通路、Hippo信号通路、Toll和Imd信号通路、溶菌体、细胞骨架调节、病毒性的肿瘤发生、PI3K-Akt信号等信号传导和代谢通路。本文取得的研究成果有利于从分子水平上深入理解家蚕乃至其它昆虫抵御真菌侵染的防御机理,也为家蚕的抗菌育种提供理论依据。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：江苏科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S884.31

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本文编号：1503167