SIRT1基因在人工关节无菌性松动发病过程中的作用及相关机制研究

发布时间：2018-02-16 01:47

本文关键词： 无菌性松动 SIRT1 磨损微粒巨噬细胞成骨细胞骨溶解 NF-κB p53　出处：《南京大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:人工关节无菌性松动(aseptic prosthesis loosening)作为初次全髋关节置换术及全膝关节置换术远期失败的最主要的原因之一,与假体周围慢性炎症和骨代谢紊乱密切相关。目前国内外对于无菌性松动的机制研究主要集中于局部多种细胞与磨损微粒间的相互作用,主要表现为人工关节假体周围的慢性炎症以及骨溶解的发生。然而,多年大量的研究并未探明无菌性松动发生发展的具体机制以及有效的防治手段。而Sirtuin 1(SIRT1)基因已经被越来越多的研究证明参与与衰老相关的一系列疾病,如神经退变性疾病、代谢性疾病、心血管疾病、肿瘤以及骨质疏松的发生和发展。最新的研究表明,在SIRT1基因敲除小鼠中可观察到由于显著的骨形成减少而导致的的骨量下降。另一方面,在多种炎性疾病,如类风湿关节炎中,SIRT1基因也发挥着关键有效的抗炎作用。而SIRT1基因是否在人工关节无菌性松动的发生发展中发挥作用,其具体机制如何,能否作为无菌性松动治疗的有效靶点,目前研究尚未清楚。方法:我们首先在临床上收集了初次髋关节置换术后发生无菌性松动患者的临床资料与假体周围的界膜组织,并以无松动患者的临床资料及假体周围组织作为对照组。应用Western Blot与免疫荧光的方法在无菌性松动患者与无松动患者的组织中检测SIRT1基因的蛋白表达是否有明显差异,并应用ELISA的方法检测无菌性松动患者与无松动患者组织中炎症因子的表达。然后通过制备了两种常见的人工关节假体金属磨损微粒(TiAlV4和CoCrMo微粒),体外刺激单核-巨噬细胞和成骨细胞,ELISA检测以及qPCR检测单核巨噬细胞及成骨细胞内炎症因子表达的变化,MTT检测成骨细胞数量的变化以及流式细胞术检测成骨细胞凋亡的情况;利用SIRT1激活剂白藜芦醇以及SIRT1的抑制剂EX527明确SIRT1与磨损微粒诱导慢性炎症及成骨细胞凋亡的关系。并进一步通过慢病毒转染在单核巨噬细胞及成骨细胞中过表达SIRT1,寻找SIRT1与磨损微粒诱导慢性炎症及成骨细胞凋亡密切相关的直接证据,并进一步探究SIRT1下游基因的表达及信号网络。最后构建小鼠颅骨骨溶解模型,并使用白藜芦醇进行干预,microCT及甲苯胺蓝观察小鼠模型骨溶解的情况,ELISA及qPCR检测类界膜组织及骨组织中的炎症因子表达,HE染色和qPCR观察成骨细胞的数量及功能,进一步探究SIRT1作为人工关节无菌性松动治疗靶点的可能。结果:初次髋关节置换术后发生无菌性松动的患者假体周围组织中SIRT1的蛋白表达显著低于对照组。磨损微粒能诱导单核-巨噬细胞及成骨细胞内SIRT1蛋白的表达下调,并能显著促进炎症因子的表达(IL-6、TNF-α、IL-1β)。另一方面,磨损微粒也能在体外显著减少成骨细胞的数量以及促进成骨细胞凋亡。而SIRT1的激活剂白藜芦醇能通过NF-κB信号通路显著抑制磨损微粒诱导的巨噬细胞和成骨细胞的炎症因子表达水平的上升,并能通过p53信号通路显著抑制磨损微粒诱导的成骨细胞的凋亡。SIRT1在巨噬细胞及成骨细胞中过表达能显著抑制磨损微粒刺激的炎症因子的表达水平上升及成骨细胞凋亡。白藜芦醇在小鼠颅骨骨溶解模型中能显著降低骨溶解的严重程度,也能显著降低类界膜组织及骨组织中炎症因子的表达,并能显著提高成骨细胞的数量、碱性磷酸酶(ALP)的活性以及骨形成相关基因的表达(Runx2、Ocn、Dkkl、Sost、Osx)。结论:SIRT1基因在人工关节无菌性松动的发生机制中发挥着重要作用,SIRT1能抑制磨损微粒诱导的局部炎症反应和成骨细胞的凋亡。本研究揭示了人工关节无菌性松动的一种新的治疗策略,为该疾病的治疗及药物研发提供了一个潜在的靶点。
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【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R687.4

【参考文献】