家蚕Hippo通路主基因BmYki的克
本文关键词： 家蚕 Hippo通路 BmYki 表达 功能 出处：《西南大学》2016年硕士论文 论文类型：学位论文
【摘要】：Hippo通路是近年发现的一条通过调控细胞生长、增殖及凋亡等过程从而控制器官大小的重要信号转导通路,该通路在果蝇及哺乳动物中非常保守。转录共激活因子Yorkie(Yki)是Hippo通路下游的核心成员,Hippo通路主要经由Yki调控下游靶基因进并实现控制器官大小的功能。家蚕是著名的经济昆虫和鳞翅目模式昆虫。研究家蚕器官大小调控相关信号通路及其关键基因,对于揭示鳞翅目昆虫的共有生物性状以及利用基因靶标改造家蚕的生产性能,具有重要理论价值和现实意义。本研究以家蚕Hippo通路下游的转录共激活因子BmYki为靶标,对其进行克隆以及基因结构、亚细胞定位、时空表达特征等分析,并重点在细胞水平上探究其生物学功能。取得的主要结果如下:1、BmYki基因的克隆及序列特征分析自家蚕中鉴定并克隆了BmYki基因的CDS序列,其中从二化性大造品系中克隆了3种剪接形式BmYki-S1、BmYki-S2和Bm Yki-S3,从多化性黄血品系中克隆了4种剪接形式BmYki-S1、BmYki-S2、BmYki-S3和BmYki-S4。这是迄今为止首次发现转录共激活因子Yki存在多种选择性剪接形式。2、BmYki基因的亚细胞定位分析选取BmYki-S1和BmYki-S2两种剪接形式,构建了BmYki-S1和BmYki-S2分别与EGFP融合的亚细胞定位表达载体,转染家蚕卵巢细胞株BmNs并进行DAPI染色和荧光观察,结果表明BmYki-S1和BmYki-S2均定位在BmNs的细胞质中,这与果蝇及哺乳动物Yki基因的定位结果类似。3、BmYki基因的组织和发育时期转录表达分析利用荧光定量PCR技术,对BmYki基因在五龄第3天家蚕各主要组织以及一龄1天至化蛾1天等发育时期的表达特征进行了分析。结果表明,Bm Yki基因在检测的各组织和发育时期的表达水平较低,其中在后部丝腺和中部丝腺的表达水平相对最高,在精巢、卵巢、气管、头部的表达水平相对较高,在脂肪体、血液、马氏管、前部丝腺中的表达水平相对最低。BmYki基因在五龄3天和化蛾1天各有一个表达峰值,其中五龄3天的峰值最高,其他各发育时期的表达水平较低。BmYki基因在丝腺以及丝蛋白开始大量合成的五龄第3天表达最为活跃,暗示其可能参与了丝腺或丝蛋白合成调控。4、BmYki基因的细胞超表达分析利用GAL4/UAS双元表达系统,在家蚕胚胎细胞株BmE中过表达BmYki基因,然后对11个已知的Hippo通路下游靶基因以及11个丝蛋白合成相关基因的表达情况进行荧光定量PCR检测,结果显示:下游靶基因Myc、Ras、E2F1、Diap1、Caspase1、Kibra和Ex均有显著上调表达;Diap2、Caspase9略有上调表达;Wg略有下调表达;CycE和基因无明显变化;丝蛋白合成相关基因FibH、P25、Seri1、Seri2、Seri3、SGF1、SGF2和SGF3出现明显下调表达;FibL、Sage和Dimm无明显变化。上述结果表明,家蚕BmYki(Hippo通路)具有调控细胞增殖及凋亡等生物学过程的功能,并参与了丝蛋白合成相关基因的表达调控。5、BmYki基因的细胞敲除分析利用CRISPR/Cas9系统,在家蚕胚胎细胞株BmE中进行了BmYki基因敲除,然后对11个已知的Hippo通路下游靶基因以及11个丝蛋白合成相关基因的表达情况进行荧光定量PCR检测,结果显示:敲除BmYki基因后,下游靶基因Myc、Ras、Diap1、Caspase9、Caspase1、Kibra和Wg均出现下调表达,这一变化趋势与超表达BmYki相反;而丝蛋白合成相关基因的变化趋势与超表达BmYki基本一致,其中FibH、P25、Ser1、Ser2、Ser3、SGF1、SGF2和SGF3出现下调表达。
[Abstract]:In this paper , we have studied the gene structure , the gene structure , the gene structure , the subcell localization , the space - time expression characteristic of the gene target gene . The results show that the expression level of the Bm Yki gene is lower than that of the Yki gene . The results showed that the downstream target gene Myc , Ras , Diap1 , Caspase9 , Caspase1 , Kibra and SGF3 were downregulated . The results showed that the change trend of the downstream target gene Myc , Ras , Diap1 , Caspase9 , Caspase1 , SGF2 and SGF3 was downregulated .
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78
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，本文编号：1521282
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