家蚕核型多角体病毒BmNPV orf90基因的功能研究

发布时间：2018-02-24 02:45

  本文关键词： 家蚕核型多角体病毒 Bm90基因 λRed重组系统 Bac-to-Bac系统 透射电子显微镜 荧光定量PCR　出处：《浙江理工大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus,BmNPV)是核型多角体病毒属的典型代表,近年来,对BmNPV基因功能的探索从未停止,但仍有很多基因的功能未知。BmNPV orf90(Bm90)基因是BmNPV基因组中一个未知功能的保守基因,本文以Bm90基因为研究对象,深入研究该基因在整个病毒感染周期中对病毒复制、转录及组装等方面的影响。利用λRed重组系统和Bac-to-Bac系统构建带有多角体基因(polh)和增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)的野生型病毒WtBacmid-polh-egfp、Bm90基因缺失型病毒Bm90ko-polh-egfp-Bacmid及Bm90基因回补型病毒Bm90re-polh-egfpBacmid。将3种重组病毒分别转染家蚕卵巢细胞BmN,病毒滴度测定发现Bm90基因缺失型病毒的滴度值为零,即Bm90基因缺失使病毒失去了产生侵染性子代病毒粒子的能力。收集转染重组病毒48 h后的BmN细胞进行透射电镜观察,进而分析Bm90基因缺失对子代病毒粒子组装的影响,电镜观察结果发现在野生型和回补型病毒转染的BmN细胞中存在大量的子代病毒粒子及病毒发生基质,而Bm90基因缺失型病毒转染的BmN细胞中没有子代病毒粒子及其他典型的杆状病毒感染症状出现,表明Bm90基因是子代病毒粒子组装的必需基因。qPCR分析结果发现野生型与回补型病毒的复制水平在12 h到96 h不断增加且两者差异不显著;而Bm90基因缺失型病毒的复制水平在12 h到48 h不断增加,与野生型和回补型病毒复制水平相当,但48 h后Bm90基因缺失型病毒复制水平保持不变且显著低于野生型和回补型病毒的复制水平(P0.05),表明Bm90基因不是病毒复制的必需基因,但显著影响病毒的复制水平。qRT-PCR分析结果显示Bm90基因的缺失使家蚕核型多角体病毒BmNPV早期基因lef-3、晚期基因vp39和极晚期基因p10的转录水平均具有显著性的下调(P0.05),表明Bm90基因在病毒周期中对其他病毒基因的表达起调控作用。此外,构建原核表达体系PET-28a-Bm90表达纯化Bm90蛋白并免疫新西兰大白兔,获得了Bm90蛋白的多克隆抗体,抗体效价达12800U。Western blot结果发现Bm90蛋白在转染BmN细胞后72 h有表达,表明Bm90基因可能是病毒晚期表达基因。
[Abstract]:Bombyx mori NucleopolyhedrovirusBmNPV (Bombyx mori) is a typical representative of nuclear polyhedrosis virus. In recent years, the function of BmNPV gene has never stopped. But there are still many genes whose function is unknown. BmNPV orf90 (Bm90) gene is a conserved gene in the BmNPV genome. In this paper, the Bm90 gene is taken as the research object to study the replication of the gene in the whole virus infection cycle. Construction of wild-type virus with polyhedrosis gene (polh) and enhanced green fluorescent protein gene (GFP) by means of 位 Red recombination system and Bac-to-Bac system. WtBacmid-polh-egfpm90 gene deletion virus Bm90ko-polh-egfp-Bacmid and Bm90 gene complement type virus are constructed by means of 位 Red recombination system and Bac-to-Bac system. Bm90re-polh-egfpBacmid.Three recombinant viruses were transfected into Bombyx mori ovary cells BmN.The titer of Bm90 gene deletion virus was zero. That is to say, the Bm90 gene deletion caused the virus to lose the ability to produce the infective virus particles. The BmN cells transfected with recombinant virus for 48 h were observed by transmission electron microscope, and the effect of Bm90 gene deletion on the assembly of the offspring virus particles was analyzed. The results of electron microscopy showed that there were a large number of progeny virus particles and virogenic matrix in BmN cells transfected with wild type and compensatory virus. However, no offspring virus particles or other typical baculovirus infection symptoms appeared in BmN cells transfected with Bm90 gene deletion virus. The results showed that the replication level of wild type virus and complementary type virus increased from 12 h to 96 h, and there was no significant difference between them. The replication level of Bm90 gene deletion virus increased from 12 h to 48 h, which was similar to that of wild type virus and compensatory type virus. But after 48 hours, the replication level of Bm90 gene deletion virus remained unchanged and was significantly lower than that of wild type and compensatory virus, indicating that Bm90 gene was not an essential gene for virus replication. But the results of QRT-PCR analysis showed that the deletion of Bm90 gene resulted in significant down-regulation of transcription level of BmNPV early gene lef-3, late gene vp39 and extremely late gene p10 of Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus. Bm90 gene regulates the expression of other viral genes during the viral cycle. A prokaryotic expression system, PET-28a-Bm90, was constructed to express and purify Bm90 protein and immunize New Zealand white rabbits. The polyclonal antibody of Bm90 protein was obtained. The antibody titer reached 12800 U. Western blot. The results showed that Bm90 protein was expressed 72 hours after transfection of BmN cells. It is suggested that Bm90 gene may be a late expression gene of the virus.
【学位授予单位】：浙江理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78;Q939.4

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