35同源重组法构建多功能农药降解基因工程菌研究

  本文关键词：同源重组法构建多功能农药降解基因工程菌研究，由笔耕文化传播整理发布。

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同源重组法构建多功能农药降解基因工程菌研究

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蒋建东，顾立锋，孙纪全，代先祝，文阳，李顺鹏"

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南京农业大学生命科学学院，农业部农业环境微生物工程重点开放实验室，南京

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摘要构建遗传稳定的多功能农药降解基因工程菌可以为农药污染的生物修复提供良好的菌种资源，然而，构建遗传稳定

且不带入外源抗性的基因工程菌是一个难点。通过以受体菌的"#H/I*8为同源重组指导序列、&+0.基因为双交换正筛选标记构建同源重组载体，二亲结合的方法将甲基对硫磷水解酶基因（;?@）整合到呋喃丹降解菌4?"#$1(;($+&>9)JIHQ"染色体的分别成功构建了含"个和!个;?@基因插入到/I*8位点且不带入外源抗性的基因工程菌株JIHQ-93和JIHQ"#H/I*8位点，

!-93。同源重组单交换的效率为R_7‘"$a7b#_P‘"$a7。通过GJ0和H’5:=,/6杂交的方法验证了同源重组事件。基因工程菌遗传稳定，能同时降解甲基对硫磷和呋喃丹。甲基对硫磷水解酶（cGM）的比活在各生长时期均高于原始出发菌株，比活最高达#_!!-5N!B。关键词

基因工程菌，农药降解，生物修复同源重组，/I*8，&+0.，

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文献标识码

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中图分类号

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国家“十五”科技攻关重点项目（*’)!$$KL8%"#8$!）、国家高技术发展计划“P#R”（*’)!$$K88!K#$7$、和江苏省研究生创新计划!$$K88!"K"$）项目资助。

蒋建东等：

同源重组法构建多功能农药降解基因工程菌研究

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化学农药是一类重要的环境异生物（;".-0,-’,/，其在环境中的生态学行为以及修复一/-&+-2.!3）

［?］

直是国内外研究的重点。目前，科研工作者已经分离筛选了大量降解农药的微生物，并成功地将降

［B］解性微生物应用于污染环境的修复。然而农药品

，它与其它报道的有机磷水解酶基因*"#GSJJTUBV）

和*"’-B同源性很低。!"#基因编码的酶789能够高效水解78为对硝基苯酚（8F8）和W，W>二甲基硫

［?B，?J］

代磷酸。789虽然不能完全矿化78，但水解生成的8F8的毒性比78低?XXM?BX倍。呋喃丹的微生物降解研究相对较少，本实验室的武俊从活性污泥中分离到一株能够高效、快速降解呋喃丹的

［?K］鞘氨醇单胞菌&"’(%)*!*%+,3+4Y<L>?，该菌株能完全矿化呋喃丹，通过气质联机分析发现呋喃丹首

种繁多，环境中农药污染情况复杂，降解单一农药的微生物菌株已经不能满足生物修复的需求，通过生物学手段构建多功能的农药降解基因工程菌株成为

［J，K］

新的研究热点。

由于质粒的不稳定性且含有抗性所带来的环境释放潜在风险，将外源基因构建于质粒载体而获得的基因工程菌的应用越来越受到限制。因此，目前迫切需要发展一种能将外源目的基因整合到受体菌的染色体上且不带入抗性的整合系统。尽管依赖于插入序列（DL）介导的整合方法也能获得遗传稳定的工程菌株，然而，同源重组可以按照人们所预期的基因位置甚至碱基序列位置进行染色体整合而倍受青睐。?@L$EFG基因（$<FG）存在于所有的细菌中，作为分子进化钟在微生物的系统分类进化及分子生态学研究中得到了广泛的应用，而且$<FG一般以多拷贝（M?N个拷贝）的形式存在，因此，若以此作为同源重组整合位点，则会提高整合几率，而且不会因为插入失活掉一个$<FG操纵元（$$%）而将受体菌致［NO??］死。国内外一般是将克隆到的某个非致死基因作为同源重组指导序列（9-&-*-#-23E"/-&0,.%’,-.

，而以$<FG为同源重组整<,$"/’,.#L"P2"./"，9E<L）合位点稳定表达外源基因的研究相对较少。

甲基对硫磷（78）和呋喃丹为两种剧毒农药，虽然使用受到限制，但其造成的环境污染问题仍很严重。世界各地的科研工作者分别从/,01#*!*%+,

属、.$1-022+属、32+4*5+-60$(1!属、72-+2()0%0,属和本实验8-’$*5+-6$1!分离筛选到一些78降解菌株，

室的崔中利博士用鸟枪法从78降解菌株从克隆到一个新的甲基对硫磷水解酶基因!"#（H".Q%.R

先是断开氨基甲酸酯链，形成呋喃酚，实验中还检测到有红色中间代谢产物B，K>二叔丁基苯醌的存在，

其余代谢途径还未见报道。本文以高效呋喃丹降解菌&"’(%)*!*%+,3+4Y<L>?的?@L$<FG为同源重组位点整合甲基对硫磷水解酶!"#基因，获得不带抗性标记的能同时高效降解78和呋喃丹的工程菌株，为基因工程菌的环境释放以及生物修复应用打下坚实的基础，并且为遗传稳定基因工程菌的构建提供了一种新的思路与方法。

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材料与方法

材料

本实验中使用的菌株和质粒见)*)*)菌株和质粒：表?。

限制酶、碱性磷酸酶、)*)*+试剂与试剂盒：5K<FG

连接酶、随机引物标记试剂盒（E%.!-&8$,&"$<FG

购自大连宝生物工程有限公司=%0"*,.#Z,’["$4B）

（5%Z%E%Q,-’"/(.-*-#)（<%*,%.）Y-4=’!），抗生素购自

江苏创瑞公司，<FG片段纯化回收试剂盒购自其它试剂均为分析纯。NX\的78乳H".0%3"公司，

油和VT\呋喃丹原药分别购自镇江农药厂和太仓鲍利葛化工有限公司。（标记的!Y58购自北>JB8）"京市福瑞生物工程公司；所用引物由大连宝生物工程有限公司合成。

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表!菌株和质粒的基本特性

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无机盐、!4!45培养基：=Q培养基配方见参考文献

［8C］；8ZG=Q培养基为稀释G倍的=Q；=QL培养基中为=Q中添加8DD:Z+=浓度的LU；!=Q培养基中&为=Q中添加?[的蔗糖。根据实验需要添加相应的抗生素，氨苄青霉素（Y+)）为?D卡那霉素:Z+=，&（R+）为E?链霉素（!"#）为8DD:Z+=，:Z+=。&&!46方法!464!

细菌培养：0*1#,9$1#$)1’2$为=Q培养基GF\

培养，!"#$%&’(’%)*’)456!78为8ZG=Q培养基GD\

培养。

细菌总6WY的制备、酶!4646分子生物学操作：

切、酶连、载体脱磷、转化、041’2$普通感受态制备、质粒提取、［8C］；!(1">.#&杂交等操作见参考文献6WY的回收纯化按照试剂盒说明书进行；6WY测序委托大连宝生物公司完成；实验中所用的引物及U5-扩增条件列于表E。

表6引物及789扩增条件

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  本文关键词：同源重组法构建多功能农药降解基因工程菌研究，由笔耕文化传播整理发布。