miR-130a在肺癌中的表达及相关靶基因和肺癌发病机制探讨

发布时间：2018-02-28 13:46

本文关键词： 肺癌 miR-130a 靶基因GOLPH3 细胞增殖凋亡　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景迄今为止,肺癌占据着世界范围内包括中国的肿瘤发病第一位[1]。肺癌按病理分类分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占全部肺癌的85%左右。近十年来,肺癌的诊断以及治疗有了划时代的发展,除了经典的三大治疗如手术、放疗、化疗,从EGFR、ALK基因重排等等方面肺癌的治疗进入了新的靶向时代,吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、克唑替尼、迈瑞替尼(AZD9291)等等药物的发展使得肺癌的生存率已经有了很大的提高,然而对于中晚期肺癌来说,5年的生存率仍不容乐观犯]。目前诊断为Ⅲb或IV期的肺癌患者,最主要的治疗手段仍然是放化疗,当然新的分子靶向治疗也已经进入一线治疗。然而化疗的效果仍然是差强人意,肺癌晚期患者无进展生存时间(PFS)仅为3-5个月,OS大约在8-10个月左右船]。目前肿瘤的医疗已进入精准治疗的时代,有明确驱动基因检测,并接受相应的分子靶向治疗使得肺癌晚期患者的缓解率高达72%左右,肺癌患者患者5年的生存率希望大幅度提高,但是目前也有研究证实,肺癌EGFR-TKI的治疗往往在治疗11月左右时候出现耐药Ⅲ,因此为改善肺癌患者的生存时间和生活质量,在基因蛋白组学、表观遗传学开展的如火如荼的时候,从基因角度去寻找潜在的肺癌发病机制和合适的治疗靶点对于肺癌的诊治具有至关重要的意义。目前有大量关于miRNAs的研究,提示miRNAs是一种新型肿瘤标记物可能。miRNAs也有癌基因和抑癌基因功能,目前认为miRNAs和肿瘤的发生发展有着密切的关系,因此深入研究miRNAs和肺癌发病机制的关系,有可能为肺癌的诊治提供新靶点。miR-130a是近年来发现的一个miRNA分子,研究发现,miR-130a能够影响MAPK、AR信号通路活性,抑制前列腺癌的增殖、侵袭转移,发挥着抑癌基因的功能㈨。更多的研究显示,miR-130a也能够抑制乳腺癌、肝癌细胞的增殖、侵袭转移睛]。目前,miR-130a在肺癌中的表达及作用尚不明确。本研究拟通过免疫印迹法、定量PCR法、Transwell法及荧光素酶报告实验等技术来研究miR-130a在肺癌发生发展中的作用。目的：通过基因芯片筛选出肺癌细胞及对照组上差异表达的miRNA分子,选出miR-130a后检测其在人肺癌组织中的表达并分析其与肺癌临床病理特征之间的关系；并研究miR-130a在肺癌中的生物学功能和发病机制。方法：1、本实验选用Affymetrix芯片检测2种肺癌细胞系(A459和Calu-3)及对照的正常支气管上皮细胞中的miRNAs表达情况。验证芯片数据准确可靠后挑选miR-130a作为研究对象。2、采用实时定量PCR (qRT-PCR法)检测miR-130a在人肺癌组织中的表达,采用脂质体法将miR-130a mimic转染肺癌细胞株A549和Calu-3,通过CCK-8试验、流式细胞术、EdU细胞增殖检测、Transwell实验等方法观察miR-130a对肺癌细胞生长、增殖、侵袭等影响。3、预测、验证miR-130a相应的靶基因,进一步研究其和肺癌的发病机制关系：利用公认的target靶基因预测软件,筛选出GOLPH3基因可能为miR-130a的下游靶基因。然后在肺癌细胞系中利用qRT-PCR法和western blotting检测过表达和抑制miR-130a对GOLPH3基因mRNA的影响以及相应的蛋白水平的改变。荧光素酶报告实验验证miR-130a对GOLPH3的反馈调控作用,进一步探索miR-130a在肺癌发病上的调控机制。结果：1、Affymetrix芯片检测显示,和正常肺上皮细胞系(HBE)相比,肺癌细胞系(A459和Calu-3)中表达上调的miRNA有24个(fold change2),如hsa-miR-25、 hsa-miR-222、hsa-miR-30e、hsa-miR-320e、hsa-miR-22、hsa-miR-16等,表达下调的有19个(fold change0.5),如hsa-miR-9、hsa-miR-130a、hsa-miR-21、 hsa-miR-205等。查阅了有关的文献,我们认为miR-130a在多种肿瘤如胃癌、肝癌等中表达异常,提示我们miR-130a可能与肿瘤细胞增殖、凋亡有关,但是其在肺癌中的表达变化及其功能研究方面报道甚少。最终我们选择miR-130a作为下一步的研究对象。为使得研究结果可靠,我们采用实时定量RT-PCR法验证miR-130a在肺癌组织和细胞中的表达,结果提示在肺癌组织和肺癌细胞中miR-130a表达较对照组均显著下调,与芯片结果吻合。提示miR-130a和肺癌的发病机制有密切关系。2、在不同组织类型比较中,小细胞肺癌和非小细胞肺癌间miR-130a表达水平无明显差距(data not shown) (P0.05);非小细胞眭鳞癌组织miR-130a;菱达(0.68±0.13)低于肺腺癌(P0.05)；此外,淋巴结转移组(NI)患者的miR-130a表达(0.41±0.06)明显低于淋巴结未转移组(NO)(P0.05),且随着肺癌临床分期的升高,Ⅲ/Ⅳ期患者组织中表达(0.52±0.14)出现明显低于Ⅰ/Ⅱ(P0.05)；体外实验中,miR-130a转染后,CK-8实验结果显示,转染miR-130a mimic：组较正常对照组miR130a mimi及能抑制肺癌细胞的增殖；EdU实验结果提示,转染组的肺癌细胞增殖能力明显下降；小室则提示转染组较对照组对肺癌细胞的迁移与侵袭能力有明显影响；平Transwell板克隆形成实验结果提示,转染组细胞较对照组克隆形成能力减弱；流式细胞仪检测细胞周期与细胞凋亡实验结果提示,的肺癌细胞克隆形成率远低于对照组细miR-130a胞,另外转染组的肺癌细胞出现了G1/S期阻滞,表明表达升高后通过调控miR-130aG1/S期转换来抑制肺癌细胞的生长。裸鼠皮下成瘤实验显示转染组的裸鼠成瘤能力较对照组显著减弱。3.从生物信息软件中,我们预测可能是GOLPH3作用的靶基因之一。miR-130a检测了western blotting蛋白在肺癌组织、肺癌细胞以及对照组中的表达情况,发现GOLPH3其在肺癌组织中的表达明显高于癌旁组织。进一步采用验证qRT-PCR蛋白和GOLPH3值,成功构建mRNA质粒后,在pGL3-GOLPH3-Mut野生型重组质粒中,转染GOLPH3组的荧光强度比值(0.61±0.11)较转染阴性对照(1.27±0.05)明显降低,mimicsp0.01；在突变型重组质粒中,转染组的荧光强度比值(1.33±0.06)对比转GOLPH3染阴性对照(1.30±0.05)两者比较无明显差异,pO.05；表明是通过结miR-130a厶口GOLPH3的3'-UTR对GOLPH3进行调控,另外发现过表达miR-130a后GOLPH3的蛋白表达明显抑制,但mRNA的表达变化不大,提示miR-130a可以抑制含有其结合位点的报告基因的活性,而对突变质粒没有影响。说明生物信息学软件的预测结果是准确可靠的。进一步westernblotting发现miR-130a过表达后,靶基因GOLPH3下游周期蛋白Cyclin E1、CyclinD1、GAPDH表达均出现了明显下降,提示miR-130a的表达与GOLPH3表达呈负相关。另外转染miR-130a mimics与pGL3-GOLPH3-Mut 3'-UTR后,与仅过表达miR-130a组肺癌细胞相比,GOLPH3和WIS、β-catenin表达升高,提示miR-130a可能是通过WNT/WIS通路影响肺癌的发生发展。结论：1.从芯片检测和RT-PCR实验结果来看,证实了miR-130a在肺癌组织/细胞中的表达较对照组显著降低,提示miR-130a和肺癌的发生发展有一定的相关性。2. miR-130a表达增加能抑制肺癌细胞体内外的增殖能力、迁移与侵袭能力,促使肺癌细胞凋亡,提示在肺癌增殖、侵袭和凋亡中miR-130a艮可能起重要作用。3. miR-130a和靶基因GOLPH3呈负相关,miR-130a可能是通过WNT/WIS通路影响肺癌的发生发展,进一步深入研究miR-130a则其有望成为肺癌基因治疗的新靶点。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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