儿童非匀称性身材矮小伴骨骼畸形临床表型—基因型的相关性分析

发布时间：2018-02-28 14:09

本文关键词： 非匀称性身材矮小骨骼畸形临床表型基因型　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景随着国民经济增长和物质生活水平的提高,儿童身高问题越来越受到关注,身材矮小也逐渐引起人们重视。身材矮小若未得到及时准确的诊断并尽早干预,将给个人、家庭乃至全社会带来沉重的精神和经济负担。矮小症(Short stature,SS)是儿科常见病,是指生活在相似环境下的同性别、同年龄和同种族的个体身高低于正常人群平均身高2个标准差者,或低于第三百分位数者。SS根据患儿体型的匀称程度可分为匀称性身材矮小和非匀称性身材矮小两种类型。值得注意的是,非匀称性身材矮小常合并有骨骼畸形(Skeletal dysplasia,SD)。据统计,SD的总体出生发病率为1/5000,这占了所有患有出生缺陷儿童的5%。然而,由于诊断条件所限、漏诊误诊等原因,SD的真实发病率可能更高。此外,SD患儿除通常表现的肌肉骨骼系统的异常外还常同时合并多系统功能的异常,包括听力、视力、神经系统、呼吸系统、心脏、肾脏和心理等方面,导致患儿严重的身体残疾,日常生活无法自理甚或早年夭折。由于SD典型的遗传异质性,早发现、早诊断和早干预可能是减少其伤害最有效的方法之一。然而,SD包含数百种遗传和临床表现高度异质性的疾病,这给疾病的精准诊断和治疗带来了巨大的挑战。依照《国际遗传性骨病分类标准2015年版》,遗传性骨病(Genetic skeletal disorders,GSD)的总数达436种,并根据其分子遗传、生化及影像学的特点分为42组;与疾病相关的基因数也从2010年报告的226个增至364个。常见的GSD有:股骨头缺血性坏死(Avascular necrosis of the femoral head, ANFH)、软骨发育不全(Achondroplasia, ACH)、脊柱骨骺发育不良(Spondyloepiphyseal dysplasia, SED)、多发性骨骺发育不良(Multiple epiphyseal dysplasia,MED)、成骨不全(Osteogenesis imperfect, OI)等等。在过去的十年里,对众多GSD相关分子机制方面的研究已经取得了显著性的进展。然而,有关临床表型与基因型之间的关系仍知之甚少。因此,完善的临床资料——逐步深入的诊断——揭示分子致病机制,不仅能为临床医生提供鉴别诊断思路,还将为科研工作者更深入地研究基因功能提供线索。然而,迄今为止,对此类表现为非匀称性身材矮小伴SD的GSD的类似研究仍非常罕见。研究目的1.对纳入本研究的7个典型的非匀称性身材矮小伴SD家系的临床资料进行总结分析。2.对所有纳入本研究的患者进行相关致病基因的筛查,明确致病基因及相应的突变位点及类型。3.选取新发的突变,对其进行相关的生物信息学分析,预测其对蛋白质结构改变的影响。4.探讨非匀称性身材矮小伴SD临床表型与基因型的相关性。5.为广大临床医生提供系统的非匀称性身材矮小伴SD的临床诊断思路。研究对象和方法1.研究对象:山东省立医院小儿内分泌科自2015年9月至2016年10月收集的7个典型的非匀称性身材矮小伴SD的家系。2.研究方法:(1)对7个典型家系先证者的遗传方式、临床表现及影像学特点进行分析;(2)对7个典型家系先证者及其家系中有类似表现的亲属进行基因突变检测,应用目标外显子捕获测序(Targeted exome sequencing, TES)技术(覆盖495个矮身材相关的候选基因)进行PCR扩增并测序。(3)选取新发的突变,对其进行相关的生物信息学分析,预测其对蛋白质结构改变的影响。(4)总结患儿临床表现、影像学特点及相关基因突变结果,明确诊断,并分析探讨非匀称性身材矮小伴SD临床表型与基因型的相关性。(5)通过文献复习,提供系统的非匀称性身材矮小伴SD的临床诊断思路。研究结果1.临床特点分析.:本研究中7个典型家系的先证者均表现为非匀称性身材矮小伴SD,例如:颈短(P1,P2, P4, P5),鸡胸(Pl,P4, P5, P6, P7),桶状胸(P2),驼背和脊柱侧凸(P4),指间关节肿胀(P3)和“三叉”手(P6)。7个先证者包括3个男性和4个女性,平均年龄为8.1岁(2岁3月-12岁)。3个患儿(P1,P6,P7)出生时起病,3个患儿(P3,P4,P5)儿童早期起病,1个患儿(P2)儿童晚期起病。所有患儿的身高均低于同性别和同年龄正常人群平均身高2个标准差,根据上部量/下部量比率(Upper-to-lower body-segment ratio, U/L)和指间距,5个患儿(P1-P5)诊断为短躯干型身材矮小,2个声儿(P6,P7)诊断为短肢型身材矮小。其他临床表型的严重程度和受累的家庭成员也各有不同。总之,根据体格检查和各参数测量的指标,7个先证者均符合非匀称性身材矮小伴SD的诊断。2.生化指标分析:7个先证者均进行常规生化指标的检测。碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase,ALP)因与儿童的生长发育相关,水平明显增高,其余生化检测指标均在正常范围。随后进行骨代谢指标的检测,25-羟维生素D ( 25-hydroxy vitamin D, 25(OH)D )水平显著减少,而甲状旁腺素(Parathyroid hormone, PTH)水平在正常范围。7个先证者起初亦被怀疑患有风湿结缔组织性疾病,然而,所有炎症和类风湿因子均在正常范围。所有实验室检查结果均不支持结缔组织性疾病的诊断。3.影像学结果:7个先证者的影像学结果均显示脊柱、骨盆和四肢的畸形,但每个患儿各有特点。7个先证者主要的影像学特征表现如下:椎体扁平、骨骺发育不良和干骺端的改变(P1);椎体扁平、椎体后缘呈“驼峰状”改变(P2);“子弹头”样的椎体、指间关节肿胀伴关节间隙狭窄(P3);脊柱侧弯、椎体扁平呈“子弹头”样的外观、股骨头和髋臼发育不良(P4);椎体扁平、椎间隙狭窄、长骨干骺端显著性增宽、双手短管状骨呈“哑铃状”(P5); L1-L5椎弓根间距逐渐变窄(P6);四肢长骨短及干骺端增宽(P7)。4.基因突变的检测:为进一步明确诊断,我们随后应用TES技术对7个先证者和他们的家庭成员进行了基因突变检测。我们分别在COL2A1、SEDL、WISP3、GALNS、TRPV4和FGFR3六个不同的基因上发现了突变,分别为P1在COL2A1基因上的杂合突变c.1636GA (G546S),P2在SEDL基因上的缺失突变1661-bp (in5/ex6del), P3在PWISP3基因上的复合杂合突变c.730GC (G244R) /c.589+2TC (splicing),P4 在 GALNS基因上的复合杂合突变 c.516_ 518delCAA (p.172delN) /c.719AG (Y240C),P5 在TRPV4基因上的杂合突变c.2395CG (P799A),P6、P7分别在FGFR3基因上的杂合突变 c.1138GA (G380R)、c.1284CA (p.N428K)。我们通过进一步检索人类基因组突变数据库(Human Gene Mutation Database, HGMD),发现了 3个新的致病性突变,包括:SEDL基因上的缺失突变1661-bp (in5/ex 6del),WISP3基因上的错义突变c.730GC (G244R)和GALNS基因上的缺失突变c.516_518delCAA (p.172delN),其余均为先前报道过的已知突变。5.生物信息学分析:为了证明本研究中3个新发突变的致病性,我们进行了生物信息学分析。人类SEDL基因包含6个外显子,跨度约20 kb的基因组DNA,编码140个氨基酸。423 bp的编码区包含外显子3 -6,而非编码区由外显子1、外显子2、外显子3的5'端和外显子6的3'端构成。起始密码子(ATG)位于外显子3,而终止密码子(TGA)位于外显子6。1661-bp的缺失包含806 bp在内含子5,99 bp在外显子6和756 bp在外显子6的3'端。人类SEDL基因的结构域包含Sedlin和N端保守性的区域(Sedlin_N;氨基酸9-136)。P2大片段的缺失包含外显子6的剪切位点,势必会造成转录和翻译的异常,进而导致蛋白结构不完整或整个缺失,因此突变的SEDL基因的蛋白功能也将受到影响。人类WISP3基因包含5个外显子,跨度约15 kb的基因组DNA,编码372个氨基酸。1119bp的编码区包含外显子1-5,而非编码区由外显子1的3'端和外显子5的5'端构成。起始密码子(ATG)位于外显子1,而终止密码子(TAA)位于外显子5。人类WISP3基因的结构域包含胰岛素样生长因子结合模块(Insulin-like growth factor binding-like module, IGFBP;氨基酸46-116)、血管性血友病 C 型重复模块(Von Willebrand type C repeat module,VWC;氨基酸117-180)、血小板反应蛋白1型重复模块(Thrombospondin type 1 repeat module, TSP-1;氨基酸207-261 )和C末端半胱氨酸结(C-terminal cysteine knot, CTCK;氨基酸 262-354)。PolyPhen-2 软件分析显示新错义突变c.730GC (p.G244R)得分为1.00,提示WISP3基因的突变可能引起蛋白功能受到损害。通过氨基酸序列比对分析显示,第244位氨基酸在多个不同物种上是高度保守的。新发突变WISP3位于TSP-1结构域,结合肝素或硫酸化蛋白聚糖调节细胞粘附和维持细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)成分,因此可能导致异常蛋白质聚集在细胞质中。人类GALNS基因有14个外显子,跨度约50 kb的基因组DNA,编码522个氨基酸。人类GALNS结构域包含N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸盐硫酸酯酶(N-acetylgalactosamine-6-sulphatase, GALNS;氨基酸 30-494)。通过氨基酸序列比对分析显示,第172位和240位氨基酸在多个不同物种上均是高度保守的。突变的GALNS可能破坏蛋白质的疏水核心区,导致错误折叠并影响其催化活性。6.明确诊断:综上所述,基于临床数据、影像学特征和基因检测结果,得出本研究中7个先证者的明确诊断。Pl诊断为先天性脊柱骨骺发育不良(Spondyloepiphyseal dysplasia congenital, SEDC),P2 诊断为 X 连锁迟发性脊柱骨骺发育不良(X-linked spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDT),P3诊断为晚发型脊柱骨骺发育不良伴进行性骨关节病(Spondyloepiphyseal dysplasia tarda with progressive arthropathy, SEDT-PA),P4 诊断为粘多糖病IVA 型(Mucopolysaccharidosis type IVA, MPS IVA) , P5 诊断为间向性骨发育不良(Metatropic dysplasia, MD),P6诊断为ACH, P7诊断为软骨发育低下(Hypochondroplasia,HCH)。研究结论1.非匀称性身材矮小伴SD的临床表型与基因型具有相关性;2. TES技术对非匀称性身材矮小伴SD患儿的病因诊断具有重要价值;3.本研究发现3个新的致病性基因突变,为其功能性研究提供线索;4.建立系统的非匀称性身材矮小伴SD的临床诊断流程。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R725.8;R726.8

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