基于猪附红细胞体α-烯醇化酶基因的LAMP检测方法的建立及初步应用

发布时间：2018-03-01 13:13

  本文关键词： 猪附红细胞体 α-烯醇化酶基因 LAMP SYBR Green I 临床应用　出处：《延边大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：猪附红细胞体病(Eperythrozoonosis)是由猪附红细胞体(Mycoplasmasuis,M.suis)寄生于猪的红细胞、血浆、组织液和骨髓中引起的一种多发性人兽共患传染病。感染宿主范围较广,如猪、牛、山羊、狗、猫等,也包括人类。多呈隐性感染使机体免疫力下降,而导致与其它猪传染病混合感染或继发感染,严重阻碍了我国养猪业的健康发展,对养殖业和公共卫生的危害较大。采取早期诊断是预防猪附红细胞体病的关键,常规的诊断方法有涂片镜检、ELISA、PCR等,但由于这些诊断方法均需要特殊的仪器和设备,以及使用者应该具备一定的专业操作技能,而不能在基层养殖场进行推广应用。环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification method,LAMP)是Notomi等人建立的一种新型核酸扩增方法,可以精准识别出靶序列的4-6个特殊区域,通过BstDNA聚合酶在恒定的温度条件下,快速扩增目的基因,经电泳形成梯形条带或SYBR Green Ⅰ染料染色后直接观察结果。LAMP具有反应快、效率高、不需要特殊仪器和可直接观测结果等优点,使其成为广大养殖场自行诊断动物传染病的新型热门方法。近几年,M.suis才被鉴定划归为支原体属(Mycoplasma),其基因组也刚被国外学者测通。α-烯醇化酶基因(α-enolase,eno)是新报道的具有粘附作用的猪附红细胞体表面功能蛋白,常被用于分子生物学诊断方法的目的基因。因此,本试验依据GenBank已发表的M.suis基因组(NC-015153.1)设计一对特异性引物,扩增M.suis的部分α-烯醇化酶基因,经TA克隆和测序,根据测序正确的α-烯醇化酶基因,在基因保守区内设计一套LAMP特异性引物,进行LAMP预试验,对其反应温度、时间、Mg2+浓度等条件进行优化筛选,并进行敏感性、特异性、重复性试验,将建立的LAMP方法用于Msuis的临床检测。结果表明,本试验成功克隆到M.suis的部分α-烯醇化酶基因,长度为864bp。建立的LAMP方法的最适反应温度为63℃,Mg2+最适浓度为6mmol/L,内外引物最适浓度比为1:6,可在50 min内完成检测反应,并且通过SYBR Green Ⅰ染料染色后可直接观察结果。特异性试验显示,对弓形虫、猪链球菌Ⅰ型、大肠杆菌和牛源瑟氏泰勒虫的基因组均无扩增,证明该方法具有良好的特异性;敏感性试验显示,可以检测的最低稀释倍数为10-6倍,即30copies/μL,比普通PCR方法的敏感度高100倍,证明该方法具有较高的敏感性;重复性试验显示,对5个不同批次模板以及对同一模板进行7次试验,证明该方法具有良好的重复性。用建立的LAMP方法对吉林省龙井市某养猪场的84份血液样本进行检测,阳性率为41%,与普通PCR相比,检出的阳性率高于普通PCR。结果显示,本试验建立的基于猪附红细胞体α-烯醇化酶基因的LAMP方法特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便、不需要特殊仪器,可通颜色直接观测结果,可用于基层养猪场M.suis的临床诊断和推广应用。
[Abstract]:Eperythrozoonosism (Eperythrozoonosism) is a multiple zoonotic infectious disease caused by M. suis, which is parasitized by Mycoplasmasuisus in pigs, plasma, tissue fluid and bone marrow. It has a wide range of infected hosts, such as pigs, cattle, goats, dogs, cats, etc. It also includes the fact that most of the occult infections of human beings reduce the immunity of the body, which results in mixed infection with other infectious diseases in pigs or secondary infections, which seriously hinders the healthy development of the pig industry in our country. Early diagnosis is the key to the prevention of Eperythrozoonosis in pigs. The routine diagnostic methods include smear microscopy and ELISA-PCR, but these diagnostic methods require special instruments and equipment. And users should have certain professional operation skills, but can not be popularized and applied in grass-roots farms. Loop-mediated isothermal amplification method Amplification (Lamp) is a new nucleic acid amplification method established by Notomi et al. 4-6 special regions of the target sequence can be accurately identified. The target gene can be rapidly amplified by BstDNA polymerase under constant temperature. The result of direct observation of the target gene by electrophoresis is trapezoidal band or SYBR Green 鈪，

本文编号：1552082