转基因食品常用检测方法的研究现状与展望

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安徽农业科学 , Journal of Anhui Agri Sci 2009, 37 ( 29) : 14066 - 14069 . .

责任编辑 　 夏静 　 责任校对 　 况玲玲

转基因食品常用检测方法的研究现状与展望
詹世红
210095) 1, 2

,陈楚芹 ,李 聪 ,肖 笑

3

4

庆高要市恒兴水产科技有限公司 , 广东肇庆 526108; 3. 南京农业大学食品科技学院 ,江苏南京 210095; 4. 南京农业大学生命科学学院 , 江苏南京

摘要 　 介绍了转基因食品的发展现状 ,简述了常用的转基因技术 ,重点罗列了食品安全控制中转基因成分的检测方法 ,并在此基础上对 不同的检测方法进行了比较。 关键词 　 转基因食品 ; 基因重组 ; 现状 ; 安全性 ; 展望 中图分类号 　Q789 　　 文献标识码 　A 　　 文章编号 　0517 - 6611 (2009) 29 - 14066 - 04
Sta tus and Prospect of Comm on D etecting M ethods of Tran sgen ic Food ZHAN Sh i2hong et a l 　 ( Institute of Food Science and Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang, Guangdong 524025) Abstract 　The p resent development status of transgenic food was introduced. Common transgenic technologies were briefly reviewed. The de2 tection methods of different transgenic components in the food safety control were emphatically listed. On this basis, different detection methods were compared. Key words 　Transgenic food; Genetic recombination; Present status; Safety; Prospect
[1]

　　 转基因技术是指利用生物技术 ,将外源基因转移到其他 物种中去 ,从而改造生物的遗传特性 ,使其在性状、 营养品质 等方面向人类所需的目标转变。以转基因生物为直接食品 或原料加工生产的食品就是转基因食品。迄今为止转基因 生物已经被广泛利用于食品领域 ,这主要是因为转基因技术 可以增加植物单位产出量 ,增强作物抗虫性和抗病性 ,提高 农产品的耐贮性以及让植物摆脱季节的影响。同时 ,转基因 技术也是培植植物新品种的主要方法。此外 , Powell等 从而降低土壤中有机物质的流失。 发 现 ,种植转基因抗草甘膦作物会加强土壤中有机物质的积聚 随着转基因技术的广泛应用 ,它的安全性问题也越来越

受到人们的重视。转基因食品的潜在问题包括 : 转基因食物 的过敏性 ; 转基因食品的毒性 ; 营养品质改变问题 ; 转基因生 物的环境安全性以及转基因技术中存在的伦理道德问题
[2]

该文从转基因食品常用检测方法研究现状的角度出发 ,探讨 了这一领域的现状与发展方向 ,以期为食品安全监测中的转 基因检测方法的选择提供依据。
1 　转基因食品发展现状

随着转基因技术的普及 ,转基因食品已经广泛地渗透到

食物链中 ,国外市场中很大分额的加工食品如饮料、 啤酒和 早餐谷类都含有转基因生物成分。目前 ,世界上的转基因食 品涵盖了植物、 动物源以及微生物源的多种食品。在转基因 植物中 ,转基因大豆、 玉米、 棉花和菜籽在商品化的转基因作 棉花和其他转基因作物播种面积已达到 8 100 万 hm , 比
2003 年增长了 20%
[3] 2

物中占到超过 99%的分额。 2004 年全球转基因玉米、 大豆、 。在中国 ,已有近 20 种转基因植物进

43

, 吉宏武

13

,黄 明

型 ,主要指利用转移或修饰相关基因 ,改变农产品生长分化、 肥料利用、 抗逆和抗虫害等性状 ,从而达到增产的效果 ; ② 控 熟型 ,这种转基因食品着重于食品的耐贮性 ,通过转移或修 饰与控制成熟期有关的基因 ,从而使转基因生物成熟期延迟 或提前 ; ③ 高营养型 ,此类食品以转基因玉米、 土豆和菜豆为 代表 ,从改造种子贮藏蛋白质基因入手 , 使其表达的蛋白质 具有合理的氨基酸组成 ; ④ 保健型 ,主要是通过转移病原体 抗原基因或毒素基因至粮食作物或其他农作物中 ,为食用者 提供预防疾病的物质。如 : 魏振林等
[4]

基因大豆油中 22 种元素含量 ,发现转基因大豆油中的 Zn、 Cr 和 Fe等一些能帮助人体预防疾病的元素含量比较高 ; ⑤ 加 工型 ,是以转基因产物作原料 ,进行再加工而得到的食品 转基因产物比原物便于加工。
[5]

。

发展程度也不一样。转基因植物的发展水平最高的主要是 应用于生产糖类以及工业用酶和脂肪上的植物。此外 ,利用 转基因植物生产食用疫苗是当前食品生物技术研究的热点 之一。 2002 年 , 中国农业科学院生物技术研究所已通过重 组 DNA 技术选育出具有抗肝炎功能的西红柿。在动物方 面 ,转基因技术在鱼类和畜产品中的应用已经有了一定的成 果。近年来 ,在鱼类产品中 ,激素基因和抗冻蛋白基因的转 移、 珠蛋白基因的转移以及用精子载体法转基因技术、 光敏 生物素标记探针检测以及 PCR 检测转基因鱼技术等方面都 取得了较大进展。而在畜产品中 ,中国已经成功的通过转基 因技术使羊乳汁中含有人类的凝血因子 , 同时具有食用和 药用价值。转基因微生物相对应用涉及面也较广 ,比较典型 的是在发酵食品工业和食品添加剂工业的应用
2　 常用的转基因技术方法
[6]

33

　( 1. 广东海洋大学食品科技学院 ,广东湛江 524025; 2. 广东省肇

由于产品对象的不同 ,转基因技术在食品工业应用中的

入了田间试验或环境释放阶段 , 6 种转基因植物被批准进行 商业化生产。 按照功能 ,转基因产品可以大致分为以下几类 : ① 增产

转基因技术通常包括 5 个步骤 : ① 取得符合要求的 DNA

基金项目 　转 基 因 生 物 新 品 种 培 育 重 大 专 项 课 题 ( 2009ZX08012 2 014B ) 。 作者简介 　 詹世红 ( 1969 - ) ,男 ,湖南常德人 ,工程师 ,从事食品加工与 安全领域的工作 。 3 通讯作者 。 收稿日期 　2009 2 2 06 08

片段 ,即“ 目的基因 ” ② ; 利用质粒或病毒 DNA 作为目的基因 载体 ,将目的基因与之连接成重组 DNA; ③ 把重组 DNA 引入 某种细胞 ; ④ 利用载体的某种显示机制把目的基因能表达的 受体细胞挑选出来 ; ⑤ 表达 , 采用合适的条件 , 得到高表达 的产物
[7]

。

应用 ICP2 检测转 MS
,

。

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14067

转基因动物食品的生产中 ,主要应用的是可遗传和非可 遗传构件。前者主要有 3 种方式 : 原核显微注射、 体细胞核 移植和精子载体法。利用这种方法所得到的转基因动物可 以在生产性能如生长速度、 营养利用率、 奶和毛的产量以及 疾病抵抗能力上都得到提高和改进。而含有非可遗传构件 的转基因动物则是把重组核酸片段直接引入动物体细胞。 外源 DNA 的导入包括 : 显微注射法、 电穿孔技术、 基因枪和 脂质体法等。目前认为转基因疫苗也含概在非可遗传构件 的范围中 ,可以诱导特定的抗原细胞免疫应答或体液来诱导 免疫反应
[8]

的 ,迄今为止 ,已经有大约 20 种蛋白质检测方法在转基因检 测领域中投入了使用。
3. 1 　 核酸水平 　当外源基因插入到靶向受体中时 ,一般要

构建启动子、 终止子、 选择标记基因和报告基因等。核酸水 平检测转基因食品主要是指检测遗传物质中是否含有插入 的外源基因 ,包括基因片断的整合位点、 多态性、 含量分析以 及启动子、 终止子、 选择标记基因和报告基因的核酸序列。 核酸水平检测转基因食物主要应用到的方法有 PCR 法和基 因芯片技术。除此之外 ,分子生物学也利用 Southern 杂交技 术检测 DNA 的特定序列。与 Southern 杂交技术相对应 ,
Northern印迹杂交主要用于测定特定外源基因 DNA 转录产

。

在植物方面 ,常用的转基因方法主要有农杆菌导入法、 基因枪介导转化法和花粉管通道法。在水稻育种中 ,利用完 整的 C4 植物玉米 pepc 基因与用作选择标记的潮霉素磷酸 转移酶基因 ( HPT )构成表达载体 ,采用农杆菌导入 ,可以提 Ⅱ 高水稻等 C3 作物的光合效率。在蔬菜转基因方面 ,导入可 以调控或表达特定酶产物的基因 ,以达到增加蔬菜抗性和产 量的作用。例如 ,利用农杆菌介导法将含有豇豆胰蛋白酶抑 制剂基因 ( CpTI)和新霉素磷酸转移酶基因 (NP I ) 的重组质 Ⅱ 粒导入普通不结球白菜中 ,从而获得具有卡那霉素抗性的再 生植株。此外 ,转基因大豆和转基因棉花都是世界关注的焦 点问题 ,中国大豆工程技术研究中心用基因工程技术将外源
DNA 导入大豆 , 培育出高抗大豆花叶病毒、 农艺性状优良以

物 mRNA 分子的大小和丰度。
3. 1. 1 　 PCR 法。 因为具有很高的灵敏度 , PCR 方法在转基

因领域使用最为广泛 (表 1 ) 。与蛋白质具有组织特异性相 比 , PCR 技术不受到材料的限制。另外核酸的性质比蛋白质 稳定 ,变性之后复性也更为容易。在现今食品安全检测领 域 , PCR 技术最广泛的应用是在检测转基因大豆和转基因 玉米。 由于 PCR 技术的高灵敏性 , 非靶片段的污染问题非常 严重 ,另外 PCR 体系中的 DNA 聚合酶没有 3 ’5 ’ 2 内切功能 , 很高的要求。一般来说 ,引物的选择比较关键 , PCR 技术中 , 引物一般为 15 ～25 nt, 引物与模板的配对率需要在 70%以 上。另外 ,上下引物的配对率要小于 5 bp, 引物自身配对率 需要小于 3 bp。 与传统 PCR 相比 ,多重 PCR 技术利用一对以上的引物 ,
[ 14 ]

所以错配的可能性较大。为了解决这些问题 , 在利用 PCR 技术检测转基因食物时 ,对于操作条件和体系原料选择都有

及产量高的大豆品种。而在棉花方面 , 自从单价 B t抗虫棉 品种和双价 (含 B t基因和 CpTI基因 ) 抗虫棉品种被培育出 后 ,现在抗棉蚜虫、 抗棉花枯萎病和黄萎病、 萝卜抗真菌蛋白 的基因 ( R 2af2P I)β2 3 2 萄糖酶基因等的转基因研究也正 1, 葡 在进行
[9]

。当然 ,转基因技术除了在农产品生产中直接使用

以外 , 植物可食性疫苗转基因也是转基因技术领域的重要 组成。 目前 ,一些新的转基因技术除了使转基因食品具备一般 发明了一种简单可控的转基因技术 , 使在转基因操作

可以同时扩增多种序列 ,从而对几个靶序列进行检测 ,可以 节省检测的时间 , 降低产物污染的可能。张平平等 以大 豆外源凝集素基因和肌动蛋白基因作为内部对照 ,运用多重
PCR 技术检测转基因大豆 ,结果表明当转基因大豆含量仅为 0. 15%时 ,仍然可以对转基因食品进行可靠鉴定 , 检测灵敏

的优点 , 还可以被后续的转基因检测提供便利。沈志成 等
[ 10 ]

时附加一个让转基因水稻对除草剂苯达松失去抗性的步骤。 这样在种植时 , 可以利用苯达松分离转基因水稻和常规水 稻。因此 ,这个技术可以用于隔离转基因作物 ,使它们在控 制条件下生长 , 从另一个层面实现了对转基因食物的安全 控制。
3 　常用的检测方法

度较传统 PCR 方法提高了很多。此外 ,多重 PCR 结合毛细 管凝胶电泳和激光诱导荧光检测激素可以同时检测 5 种转 基因玉米。 针对传统 PCR 可能出现的假阴性问题 , 巢式 PCR ( nes2
[ 15 ]

PCR 是利用两套 PCR 引物对巢式引物进行两轮 PCR 扩增反

转基因技术的安全性问题受到国内外的广泛关注。

应。第一轮扩增外引物的扩增产物被作为第 2 轮扩增的模 板 ,在内引物的存在下进行扩增。这种方法是一种很有效的 水产饲料和食品的转基因检测方法。陶冉等 的研究中采 用巢式 PCR 利用 F1R1 2F2R2 和 F2R2 2F3R3 引物对 ,检测了
32 种不同品牌的国产水产饲料 ,转基因阳性率为 90. 6% ,而

1990 年 , FAO 和 WHO 建立了有关生物技术食品安全的评估
[ 11 ]

体系。 1998 年国际生物技术研究所等机构对于转基因食物 致敏性提出了“ 树型判定法 ” 的评估策略 。美国政府为了 防止转基因玉米中的毒素提高害虫抗药性 ,规定美国玉米产 区农场至少需要种植 20%以上的非转基因玉米。此外 ,世界 上大多数国家和国际组织还专门对转基因食品实施了标识 管理。欧盟的标识管理条例利用“ 极限管理 ” 方法 ,规定如果 食品材料中有超过 1%的转基因成分 ,则需要标识
[ 12 ]

且两种引物对的阳性符合率为 100% 。半巢式 PCR 则利用 一对半引物 ,其中一个被用于 2 次 PCR 反应中。总之 ,巢式
PCR 和半巢式 PCR 都可以解决由于食品深加工对 DNA 分

。

子造成的严重破坏从而造成样品难以检测的问题。

一般来说 ,转基因检测分为两类 ,一种是核酸水平上的 ,
[ 13 ]

目前的转基因成分检测数据库中有超过 400 对 PCR 检测引 物和以及 43 种内源参照基因 。另一类是蛋白质水平上

定量荧光 PCR 法 ( RTQ 2PCR )以及反转录 RT2PCR 法。 RTQ 2
PCR 可以筛选转基因特异 DNA 片段 ,已经被一些国家作为

ted PCR ) 和半巢式 PCR ( sem i2nested PCR ) 应运而生。巢式

此外 ,常用的 PCR 法还有定量竞争性 QC 2PCR 法 ,实时

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　　　　　　　　　　 安徽农业科学 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2009 年

控制食品安全的标准检测方法。 RTQ 2PCR 常选择标记基 因 ,再检测特定转化的靶基因。实时荧光 PCR 利用杂交探 针和荧光检测 ,可以提高检测的准确性和灵敏性。由于这个 技术是采用封闭的检测模式 , PCR 产物不需要后期处理 ,有 效的解决 PCR 后污染问题。蔡慧农等
[ 16 ]

本比较高。即使如此 , 这种微型化 , 自动化的技术有着非常 大的发展前景 ,必会被越来越广泛的利用
[ 20 ]

。

由不同的 PCR 技术结合分子杂交等技术也可以改进传 统检测技术里面可能存在的问题。例如 , PCR 技术还可以和 电化学发光技术、 技术以及双探针杂交技术结合起来形 PCR 成电化学发光 PCR 法。周颖等
[ 21 ]

选择了内源基因大

豆植物凝集素 ( lectin ) 、 玉米转化酶 ( invertase ) 和外源基因 抗草甘膦除草剂的 5 2 醇式丙酮酰莽草酸 2 2 酸合成酶 烯 3磷
( cp4ep sp s) 、 抗欧洲玉米螟的苏云金芽孢杆菌杀虫毒蛋白 ( cryI b) 的 TaqMan 探针 ,建立了转基因大豆和转基因玉米 A

把三重 PCR 反应 ,毛细管

电泳以及激光诱导荧光检测结合在一起 ,代替了琼脂糖凝胶 电泳作为多重 PCR 的检测方法 ,把检出限降低到 0. 05% ,是 琼脂糖凝胶电泳检测检出限的十分之一。此外 , 周萍萍 等
[ 22 ]

的 TaqMan2 光定量 PCR 检测方法 , 初步实现可转基因食品 荧
PCR 定量分析和品种鉴定。当然 , 实时荧光 PCR 也存在其

对于转基因大豆建立了低密度基因芯片的检测体系。

此外 ,利用多重 PCR 对样品核酸进行扩增和荧光标记 ,产物 再与基因芯片杂交。这种方法避免电泳检测 PCR 的扩增产 物 ,实现了多个基因的同时检测 ; 更重要的是 ,把这两种技术 结合可以把检测和鉴定的过程合二为一。
3. 2 　 蛋白质水平 　 常用的方法有酶联免疫检测法 ( EL ISA ) 、

他问题 ,它需要特殊的热循环仪器 ,成本比普通 PCR 要高出 很多。同时 , PCR 体系中任何一项或者几项浓度的偏差都可 能导致假阳性的结果。所以 , 现今的 RTQ 2PCR 技术也在各 个方面不断改进 : 在扩增前加入 DNA 降解酶以清除扩增前 体系中的 PCR 产物 ;利用高保真酶如高质量重组热启动 Taq 性 ; 罗氏应用科学部门推出了 UPL 通用探针库 ( universal p ro2 可以识别单个碱基的错配 ,不但实现一个探针对多个基因的 检测 ,而且提高了反应的灵敏性和特异性
[ 17 ]

“ 侧流 ” 型免疫测定 ( lateral flow )和 W estern 印迹法。这几种 免疫学方法都是利用抗原抗体的高度特异性。 EL ISA 成本 较低 ,在食品安全检测中被广泛应用 ,而“ 侧流 ” 型免疫测定 操作简单也是转基因检测的常用技术 。此外 , 包括色谱 技术、 近红外波谱技术 ( N IR ) 等相关检测方法也已经建立。 但是 ,这一类方法对样品处理步骤要求较高 ,它需要蛋白质 保持一个完整无缺的 3 级或 4 级结构 ,这样在免疫检测或一 维或二维凝胶电泳蛋白结构比对时才能保证结果的准确 性
[ 12 ] [ 23 ]

定量 引物 产物污染 特点 应用

参考文献

转基因食品的检测中 ,基因芯片技术可以将一般通用的报告 基因、 抗性基因、 启动子和终止子的特异片段制成检测芯片 与待测样品杂交 ,从而判定样品中的转基因成分
[ 18 ]

在大豆、 玉米和棉花等农产品的转基因检测中广泛应用。另 外 ,基因芯片技术还可以筛选突变或抗性等转基因所需要的 目的基因
[ 19 ]

因成分 ,而食品中转基因成分的检测通常比较复杂 ,所以利 用普通 PCR 技术往往不能获得完整的信息 , 特别是大量的 测因为一次可以定性筛选大量不同种类的基因修饰物。但 是 ,这个方法也存在一些不足 ,即每种检测样品必须有与之 相配的非转基因作物的芯片 ,而且芯片检测的操作复杂 ,成

不同品系转基因食物检测的需要时。相比这下 , DNA 芯片检

DNA 聚合酶和 Easy2 高保真聚合酶等以减少错配的可能 A

belibrary) ,采用 LNA ( locked nucleic acid ) 技术合成探针。

。

表 1 　不同 PCR法在转基因检测中的比较

3. 1. 2 　基因芯片。 基因芯片又称为 DNA 微探针阵列。在

Table 1 　Com par ison of d ifferen t PCR m ethods in the tran sgen ic detec2 tion

。

否

是 一对以上 高 低 可能出现假 节省检测时间 阴性和假 阳性 定性检测转 定量检测转基 基因作物 因作物

与普通 PCR 技术比较 , PCR 技术一次只能对一种转基

PCR 法 Conven2 tional PCR

常规

PCR 法 Multip lex PCR

多重

fluorescence PCR

是

低 污染 低 , 灵 敏 避 免 假 性高 阴性 定量检测各种 原材 料、 合 混 物和加工食品 的转基因成分
[ 17 ]

[ 14 ]

。

实时定量 巢式 PCR, 荧光 PCR 法 半巢式 PCR 法 Real2tim e Nested PCR, quantitative Sem i2nested
PCR

3. 2. 1 　 EL ISA 法。 酶连免疫吸附技术实验的原理是利用抗

原和抗体的特异性免疫 ,将其中的一种包被之后 ,再将酶标 抗体结合到载体上 ,利用酶和底物的显色反映定量测定抗原 量或抗体量。在转基因食品的检测中 , EL ISA 一般作为定性 检测的方法 ,但是在某些条件下也可以用于半定量测试。利 用 EL ISA 法可以成功检测出传统加工产品中混有的 2% 是利用抗原抗体的特异性反应 ,它操作简便 ,适用于现场检 测和初筛。但是利用抗原抗体反应存在一些问题 , 例如 , 首 先不能避免的就是抗原抗体反应的专一性。其次 ,很多检测 食品是加工产品 ,其中的蛋白质的抗原性很容易被破坏。
表 2 　 PCR法和 EL ISA 法在转基因检测中的比较
tran sgen ic detection Table 2 　Com par ison between PCR m ethod and EL ISA m ethod in the

是 两套

定量 检测 转基 因水 产食 品以 及转 基因 加工食品
[ 15 ]

检测方法

,并已经

Detection methods

检测对象 检测工具 样品干扰度 灵敏度 检测品目多样性 大量筛选 定量 限制

发应用在食品安全检测领域。此项技术的原理与基因芯片

Round Ready大豆中 CP4 2EPSP 蛋白质
PCR 法 PCR method DNA

[ 24 ]

。此外 , 试纸法也

EL ISA 法 EL ISA method

寡核苷酸引物 较高 0. 01% ～0. 10% 适合 适合 适合 高度加工

蛋白质 抗体 较低 0. 5% ～1% 不适合 适合 适合 蛋白质变性

　 : 数据来自参考文献 [ 25 ]。 注

　Note: The data are from reference [ 25 ].

3. 2. 2 　蛋白质芯片。 与基因芯片对应 , 蛋白质芯片也被开

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相似 ,它可以高通量地测定蛋白质大小分子间的互相作用和 生物活性 ,也可以准确定性和定量检测目的蛋白质
[ 26 ]

。转

基因食品中 ,外源基因的最终表达产物和作用物是蛋白质 , 通过不同的探针阵列测定外源基因的表达产物 ,可以作为基 因芯片检测的补充 ,弥补基因芯片检测的不足。但是蛋白质 芯片依然存在一些难以规避的问题 , 例如蛋白质的稳定问 题 ,这就需要芯片载体材料使活性蛋白特异有序的固定。此 外 ,芯片的敏感度和成像等问题也是未来蛋白芯片发展的重 点
[ 27 ]

。

3. 2. 3 　蛋白质组分析技术。 蛋白质组差异分析技术可以用

来检测转基因植物中外源基因非预期效应。首先在蛋白质 组水平上找出转基因植物和非转基因植物的差异 ,再利用质 谱分析等技术对差异蛋白进行分析。另外 ,转基因植物外源 基因的非预期效应的安全性评价也是转基因食品安全监控 的很重要的一部分
[ 20 ]

。常规的化学方法只能检测化学成分

的变化 ,却难以准确反映外源基因产生的非预期效应。一般 来说 ,转基因植物外源基因的非预期效应的监控是利用蛋白 质组差异分析技术和基因芯片技术 ,因为这两种技术都可以 有效地比较转基因植物食品和非转基因亲本植物之间的 差异。
4 　展望

转基因检测技术的发展方向除了在传统的检测技术上 改进和几种检测技术的组合以外 ,还包括有以往没有用于转 基因食物领域的检测方法在这个领域的尝试以及全新的技 术。例如 ,色谱技术、 毛细管电泳技术、 近红外波谱技术和超 分支滚环扩增技术等 分。Hurburgh等 问题。 此外 ,免疫 PCR 被广泛应用于医药卫生领域 ,它也可以 被应用于转基因食品检测领域。传统 PCR 检测方法是利用 琼脂糖凝胶电泳分析产物 , 结果可能出现假阳性 ; 而免疫
PCR 结合了 PCR 的高效性与 EL ISA 的高特异性。该技术首
[ 29 ] [ 28 ]

。食品加工过程可能破坏植物纤维

结构 ,以致转基因检测方法难以判断食品是否含有转基因成 利用近红外波谱技术初步解决了这个

先利用 PCR 对目标核酸进行扩增 ,再用标记探针与之杂交 , 最后用碱性磷酸酶标记的链亲和素进行 EL ISA 检测 ,使检测 的灵敏度和准确度都有很大的提高 ,因此预计这种技术在转 基因食品检测领域也将具有很大的发展前景。 参考文献
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  本文关键词：转基因食品常用检测方法的研究现状与展望，，由笔耕文化传播整理发布。