Hsa-miR-328及其靶基因PLCE1在食管癌发生发展中的作用及其机制探讨

发布时间：2018-03-03 19:12

本文选题：食管鳞状上皮细胞癌　切入点：hsa-miR-328　出处：《郑州大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景食管癌是中国常见的恶性肿瘤之一,发病率在中国排在恶性肿瘤的第五位。其特点是预后差,死亡率高,死亡率居中国恶性肿瘤的第四位。食管癌的病理类型主要为腺癌和鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)。在我国,ESCC占食管癌的90%。尽管多项研究对于ESCC的发病机制进行了广泛的探讨,但是其发生发展机制目前仍不清楚。食管癌患者就诊时多处于中晚期,相当部分的病人已不能手术治疗,总的五年生存率非常低。因此,深入研究ESCC的发生发展机制,对于提高ESCC的诊断和预后具有重要的意义。微小RNA(miRNA)含有21~25个核苷酸,是一类高度保守的内源性非编码小分子RNA,与多种肿瘤的发生发展密切相关。miRNA的作用机制主要是与靶m RNA的3’非编码区(3'-untranslated region,3'-UTR)或5’非编码区(5'-untranslated region,5'-UTR)结合,最终负性调控靶基因的表达。Hsa-miR-328来源于人染色体16q22.1,可调节多种肿瘤细胞的增殖与侵袭转移,与多种肿瘤如非小细胞肺癌、胃癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、神经胶质瘤的发生发展有着密切的关系。但是,hsa-miR-328在ESCC中的表达及其对ESCC发生发展的影响未见报道。研究目的探讨hsa-miR-328及其靶基因磷脂酶Cε1(Phospholipase C epsilon 1,PLCE1)在食管癌发生发展中的作用及其相关机制。研究方法:1、实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,QRT-PCR)技术检测并比较了hsa-miR-328在82例ESCC患者癌组织与配对的癌旁组织中的表达,分析了hsa-miR-328的表达与ESCC患者预后的关系,统计了hsa-miR-328与ESCC患者的性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、分化程度和TNM分期之间的关系。2、QRT-PCR技术检测了hsa-miR-328在不同食管上皮细胞系中的表达,增殖实验、流式细胞术和transwell分别检测了hsa-miR-328对人食管鳞癌细胞EC109和EC9706增殖、凋亡、迁移和侵袭功能的影响。QRT-PCR技术检测了hsa-miR-328对EC109和EC9706细胞上皮间质转化标记物表达的影响。小管形成实验检测了hsa-miR-328在EC109和EC9706细胞的表达对人脐静脉内皮细胞HUVEC小管形成的影响,增殖实验和transwell分别检测了hsa-miR-328在EC109和EC9706细胞的表达对HUVEC细胞增殖和迁移功能的影响。3、采用生物信息学方法、免疫印迹和QRT-PCR预测并鉴定了hsa-miR-328的靶点。采用细胞增殖实验、流式细胞术和transwell观察了PLCE1对EC109和EC9706细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭功能的影响。4、采用QRT-PCR和免疫组织化学检测并比较了PLCE1在82例ESCC患者癌组织与配对的癌旁组织中的表达,分析了PLCE1的表达与ESCC患者预后的关系,统计了PLCE1与ESCC患者的性别、年龄、肿瘤位置、肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、分化程度和TNM分期之间的相关性,分析了癌组织与癌旁组织中hsa-miR-328与PLCE1表达的相关性。研究结果:1、与配对的癌旁组织比较,hsa-miR-328在食管癌组织中的表达显著降低(P0.05);64.6%的患者中,hsa-miR-328在癌组织中的表达低于配对的癌旁组织,35.4%的患者中,hsa-miR-328在癌组织中的表达高于配对的癌旁组织;Hsa-miR-328表达上调患者(hsa-miR-328在癌组织中的表达高于配对的癌旁组织)的生存期显著高于hsa-miR-328表达下调患者(hsa-miR-328在癌组织中的表达低于配对的癌旁组织)(P0.05);Hsa-miR-328的表达与性别、年龄和肿瘤位置无相关性,与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移、分化程度和TNM分期呈负相关(P0.05)。2、同人正常食管上皮细胞HEEC比较,EC109和EC9706中hsa-miR-328的表达显著降低(P0.05);慢病毒转染LV-miR-328显著增加ESCC细胞内hsa-miR-328的表达(P0.05),慢病毒转染LV-anti-miR-328显著降低ESCC细胞内hsa-miR-328的表达(P0.05);同LV-NC组比较,LV-miR-328组细胞的增殖、迁移和侵袭功能显著降低(P0.05),LV-anti-miR-328组细胞的增殖、迁移和侵袭功能显著增加(P0.05);凋亡检测表明,同LV-NC组比较,LV-miR-328组的细胞凋亡比例显著增加(P0.05),LV-anti-miR-328组的细胞凋亡比例显著降低(P0.05);同LV-NC组比较,LV-miR-328组和LV-anti-miR-328组细胞的E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白和波形蛋白的表达均无显著改变(P0.05);同LV-NC组比较,LV-miR-328组和LV-anti-miR-328组的HUVEC细胞的小管形成能力、增殖能力和迁移能力无显著改变(P0.05)。3、生物信息学方法预测PLCE1是hsa-miR-328的潜在靶点;双荧光素酶检测、免疫印迹和QRT-PCR结果表明,PLCE1是hsa-miR-328的靶点;成功构建了p CDNA3/PLCE1高表达载体;同对照组比较,p CDNA3/PLCE1组细胞的增殖、迁移和侵袭功能显著增加(P0.05),细胞凋亡比例显著降低(P0.05);同LV-miR-328组比较,LV-miR-328+p CDNA3/PLCE1组细胞的增殖、迁移和侵袭功能显著增加(P0.05),细胞凋亡比例显著降低(P0.05)。4、与配对的癌旁组织比较,PLCE1在食管癌组织中的表达显著增加(P0.05);62.2%的患者中,PLCE1在癌组织中的表达高于配对的癌旁组织,37.8%的患者中,PLCE1在癌组织中的表达低于配对的癌旁组织;PLCE1表达上调患者(PLCE1在癌组织中的表达高于配对的癌旁组织)的生存期显著低于PLCE1表达下调患者(PLCE1在癌组织中的表达低于配对的癌旁组织)(P0.05);PLCE1的表达与同性别、年龄、肿瘤位置和分化程度无相关性,与肿瘤大小、浸润深度、淋巴结转移和TNM分期呈正相关(P0.05);在ESCC患者的癌组织与癌旁组织中,hsa-miR-328与PLCE1的表达呈负相关(P0.01)。结论:ESCC癌组织中hsa-miR-328的表达降低,可增加PLCE1的表达,继而促进ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭,抑制ESCC细胞的凋亡,这可能是ESCC发生发展的机制之一。
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【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1

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