成纤维生长因子FGF21基因对成肌分化及肌纤维类型转化的调控

发布时间：2018-03-07 20:02

本文选题：小鼠　切入点：FGF21基因　出处：《华中农业大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：成纤维生长因子21(Fibroblast Growth Factor 21,FGF21)属于成纤维生长因子(Fibroblast Growth Factor,FGF)大家族中的内分泌成纤维生长因子亚家族(Endocrine FGF subfamily),该基因编码的蛋白具有分泌特性,肝脏是该蛋白的主要合成器官。不同于传统的成纤维生长因子家族成员,FGF21基因所编码蛋白的分泌特性使得它在主要脏器合成分泌后可以随着血液循环到达全身各个组织器官,通过和相应的受体以及共因子结合而发挥重要作用,因此该基因在机体的生长、发育、能量代谢、繁殖等诸多方面均具有重要作用。多年来,关于FGF21基因功能的研究主要集中在脂肪代谢、葡萄糖利用、胰岛素抵抗、肥胖等方面,由于FGF21基因不具有促进有丝分裂的作用,结合该基因在能量代谢方面的突出表现,FGF21被提名作为代谢综合征的一个潜在治疗药物而备受关注。肌肉组织在机体组成中占有重要比例,肌肉和脂肪是机体能量输出的两个最主要组织,在机体葡萄糖利用,胰岛素抵抗等方面发挥着重要作用。此外,肌肉是家畜的主要经济性状之一,长期以来,畜牧工作者致力于提高家畜的肌肉产量和肌肉质量。FGF21基因作为一个重要的能量调节因子,虽然关于该基因的研究报道大量涌现,研究成果也日新月异,但是这些研究的重点是该基因在脂肪代谢,胰岛素抵抗等方面的作用,关于FGF21基因在肌肉的发育形成过程以及肌细胞的代谢过程中是否也占有一席之地仍然不清楚。本研究主要利用实时定量PCR、蛋白质免疫印迹、酶联免疫吸附测定实验、细胞免疫荧光、免疫组织化学等实验技术,着重探讨了FGF21基因在肌肉形成过程中的作用以及该基因发挥作用的可能机制,主要结果如下所述:1.通过检测FGF21基因在细胞成肌分化过程中的表达变化情况发现,该基因的表达在细胞成肌分化过程中整体升高,其中该基因的mRNA水平在分化第2天的时候达到峰值,在分化第4天有一定回落,但是仍然高于分化前的表达水平。在蛋白质水平,FGF21胞内蛋白表达水平从分化开始至分化第6天整个过程中持续升高,分泌到培养基中的胞外蛋白在分化第2天急剧升高后一直保持在较高水平。2.分别通过超表达和干扰FGF21基因,检测了该基因在细胞成肌分化、肌纤维类型转变和能量代谢方面的作用。实验结果表明超表达FGF21能够显著或极显著(P0.05为显著,P0.01为极显著)增加成肌分化关键基因(如MyoD,MyoG)、氧化型肌纤维代表基因(如MyHCΙ)以及线粒体有氧氧化相关基因(如COX 6c,COX 8b)的表达,而干扰FGF21基因能够降低这些基因的mRNA表达水平;同样,FGF21蛋白质表达量的增加引起细胞成肌分化关键蛋白MyoD、MyoG和氧化型肌纤维中高表达的蛋白MyHCΙ、Myoglobin以及线粒体生成和功能相关蛋白PGC1α、Cox4表达上调,而FGF21蛋白表达量的降低能够下调上述蛋白的表达;此外,超表达FGF21基因促进成肌分化过程中细胞融合和肌管形成,而干扰FGF21基因后细胞的成肌分化过程受到抑制,细胞融合率下降,肌管形成受阻。3.借助肌肉特异超表达小鼠FGF21基因的转基因小鼠,在个体水平探索了FGF21基因对肌肉发育的影响,通过表型观察发现与同窝对照小鼠相比,转基因小鼠个体更小,腓肠肌肌肉组织颜色更红。通过检测基因表达变化发现转基因小鼠腓肠肌组织中的氧化型肌纤维相关基因(MyHCΙ、MyHCΠa)的表达显著高于同窝对照小鼠(P0.05),同时,转基因小鼠的腓肠肌组织中氧化型肌纤维相关蛋白表达量高于对照组小鼠。4.通过分析FGF21基因启动子区发现了转录因子MyoD的几个潜在结合位点,通过实验鉴定了转录因子MyoD能够结合FGF21基因启动子从而调控该基因的转录。5.在超表达和干扰FGF21基因后检测细胞周期相关基因的表达发现,超表达FGF21基因增加细胞周期退出基因的表达,细胞被阻滞在细胞周期的G0期,而进入S期的细胞总数显著减少(P0.05),干扰FGF21基因后细胞中细胞周期退出基因的表达量降低而细胞周期促进基因的表达量升高。6.超表达FGF21基因发现FGF21超表达细胞中AMPK被磷酸化激活,Sirt 1和PGC1α蛋白表达量升高;随后运用AMPK激活剂和抑制剂分别处理FGF21超表达细胞或对照细胞发现,用AMPK激活剂处理后FGF21超表达细胞中成肌分化相关基因和氧化型肌纤维相关基因mRNA和蛋白表达水平升高,AMPK抑制剂处理细胞中成肌分化相关基因和氧化型肌纤维相关基因mRNA和蛋白表达水平降低。综上所述,本研究发现FGF21基因具有促进成肌分化的作用,该作用受到成肌转录因子MyoD的调控,同时,FGF21基因能够促进细胞周期退出从而增强成肌分化。此外,FGF21基因能够促进氧化型肌纤维的形成,可能是通过FGF21-SIRT1-AMPK-PGC1α通路发挥作用的。该研究为FGF21在肌肉发育过程中的作用和调控机理提供了新的依据和思路。
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【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S852.2

【参考文献】