RNA干扰LIMK1基因对法舒地尔抑制尿道成纤维细胞增殖和迁移能力的影响

发布时间：2018-03-07 23:24

  本文选题：法舒地尔　切入点：RNA干扰　出处：《福建医科大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的LIMK1是调控细胞骨架的重要分子,课题组之前的研究表明,Rho激酶抑制剂法舒地尔可以下调成纤维细胞骨架运动相关蛋白LIM激酶1(LIM kinase,LIMK-1)的表达,从而抑制成纤维细胞的增殖和迁移,本研究旨在通过研究RNA干扰LIMK1对法舒地尔抑制尿道成纤维细胞迁移的影响,以阐明LIMK1是成纤维细胞迁移过程中重要的信号分子。材料和方法取原代兔尿道成纤维细胞进行体外培养,并采用RNAi技术抑制LIMK1基因的表达,RT-PCR和Western blot检测干扰效率。实验分RNA干扰组(LIMK1抑制组)和未干扰组(LIMK1正常表达组),分别加入TGF-β1(10ng/m L)和法舒地尔(50μmol/L)进行干预,共8个亚组。采用细胞划痕实验和Transwell小室侵袭实验检测各组成纤维细胞迁移能力;用流式细胞仪检测细胞凋亡率;Western-blot检测各组α-SMA、p-MLC、LIMK-1、p-Cofilin,以及I和III胶原蛋白表达情况。结果LIMK1基因抑制:Western blot结果显示与正常对照组比较,R1-R3组si RNA分别使LIMK1蛋白的表达水平降低了52%、70%、90%,R3组si RNA抑制最明显(P0.05)。RT-PCR结果显示:R3组si RNA下降最明显(P0.05)。因此,选择R3组si RNA抑制LIMK1。细胞划痕和Transwell小室实验显示:RNA干扰组在24h的细胞迁移距离和穿膜细胞数要显著少于未干扰组(P0.05),法舒地尔处理干扰组的迁移距离和穿膜细胞数要少于对照组(P0.05)。流式细胞仪检测显示:RNA干扰组的细胞早期凋亡率高于未干扰组(P0.05),且法舒地尔处理干扰组可以促进细胞凋亡(P0.05)。Westernblot检测结果显示:RNA干扰组α-SMA、LIMK-1、p-Cofilin,以及I和III胶原蛋白的表达要少于正常对照组(P0.05),而P-MLC表达无差异,法舒地尔处理干扰组蛋白表达差异具有统计学意义(P0.05)。结论RNA干扰LIMK1通过下调Rho/ROCK信号通路关键蛋白p-Cofilin、α-SMA及I、III型胶原纤维蛋白表达,抑制成纤维细胞发生增殖和迁移,并增强法舒地尔抑制兔尿道成纤维细胞增殖和迁移能力。LIMK1可以做为治疗尿道瘢痕的一个潜在新靶点。
[Abstract]:Objective LIMK1 is an important molecule regulating cytoskeleton. Previous studies have shown that the expression of cytoskeleton motility associated protein LIM kinase 1 (LIMK-1) can be down-regulated by fasudil, an inhibitor of cytoskeleton of fibroblasts. In order to inhibit the proliferation and migration of fibroblasts, the aim of this study was to investigate the effects of RNA interference with LIMK1 on the inhibition of urethral fibroblast migration by fasudil. In order to elucidate that LIMK1 is an important signal molecule in the process of fibroblast migration, the primary rabbit urethral fibroblasts were cultured in vitro. RNAi technique was used to inhibit the expression of LIMK1 gene by RT-PCR and Western blot to detect the interference efficiency. The experiment was divided into two groups: RNA interference group (LIMK1 inhibition group) and non-interference group (LIMK1 normal expression group), which were treated with TGF- 尾 1 10 ng / mL) and fasudil 50 渭 mol / L respectively. Cell scratch assay and Transwell chamber invasion assay were used to detect the migration ability of the fibroblasts. The apoptosis rate was detected by flow cytometry and Western-blot was used to detect the expression of 伪 -SMA-p-MLCp- LIMK-1p-Cofilin, and collagen I and III. Results LIMK1 gene inhibited the expression of LIMK1 protein in the control group compared with the control group. The results showed that si RNA of R1-R3 group decreased the expression level of LIMK1 protein, and the results showed that the expression level of LIMK1 protein in R1-R3 group was significantly lower than that in control group. The inhibition of si RNA in R3 group was the most obvious (P0.05N). RT-PCR results showed that the decrease of si RNA in R3 group was the most obvious (P0.05). Si RNA of R3 group was selected to inhibit LIMK1.The cell scratch and Transwell chamber experiments showed that the migration distance and the number of perforated cells in the interference group at 24 hours were significantly lower than those in the non-interference group (P 0.05), and the migration distance and the number of perforated cells in the interference group treated with fasudil were significantly lower than those in the control group. Flow cytometry analysis showed that the early apoptosis rate in the interference group was higher than that in the control group, and that in the interference group treated with fasudil could promote apoptosis. Western blot analysis showed that 伪 -SMALIMK-1 p-Cofilin, and I and III in the interference group were increased by Faxudil. The expression of collagen protein was lower than that of normal control group (P 0.05), but the expression of P-MLC was not different. Conclusion RNA interference with LIMK1 inhibits the proliferation and migration of fibroblasts by down-regulating the expression of p-Cofilin, 伪 -SMA and type III collagen fibrin in the Rho/ROCK signaling pathway. Enhancing the proliferation and migration of rabbit urethral fibroblasts by fasudil. LIMK1 may be a potential new target for the treatment of urethral scar.
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R699.6

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