利用微滴数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数

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数字PCR用于转基因检测,更加灵敏,更便捷

利用微滴数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数

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EstimatingtheExogenousGenesCopyNumberofGeneticallyModifiedOrganismsbyDropletDigitalPCR

0引言

在转基因生物研发与安全评价过程中，外源基因整合进入受体基因组的方式(位置、拷贝数和旁侧序列等)会影响目的基因和蛋白的表达以及外源基因的遗传稳定性,特别是整合的拷贝数多少影响尤为重要(Vaucheretetal.,1998)。因此，转基因生物外源基因整合的拷贝数分析是关键步骤之一，同

时也是生物安全评价的重要评价参数。目前，Southernblot和实时荧光定量PCR是常用的两种外源基因拷贝数分析技术,已广泛用于外源基因拷贝数分析。但这两种方法也存在一定缺陷。例如，Southernblot方法分析时工作量大、周期长、操作要求高、准确性较差，特别是对于多拷贝基因的分析，

结果容易偏小(Yangetal.,2005)。qRT-PCR在分析

外源基因拷贝数时必须依赖于标准曲线和已知拷贝数的基因，只是一种相对定量方法，且标准曲线的质量易受到DNA纯度、引物和探针的浓度、反应

抑制因子等诸多因素影响(Cankaretal.,2006)；另外，标准曲线必须基于标准物质建立，而标准物质的种类有限和昂贵价格不能适用于所有的研究。微滴数字PCR(dropletdigitalPCR,ddPCR)是近年来兴起的一种新的绝对定量技术，通过极度稀释实现理论上的单分子扩增，然后用终点法PCR和泊松分布计算出样品的原始浓度(Hindsonetal.,

2011)。目前，芯片式数字PCR平台已经用于测量转基因产品成分的定量分析(Corbisieretal.,2010)，但基于微滴数字PCR平台的转基因生物外源基因拷贝数的分析工作报道较少。本研究基于ddPCR平台，，建立了转基因水稻和转基因山羊的外源基因拷贝数分析方法，并与传统的实时荧光定量PCR和已报道的Southernblot结果进行了比较，研究结果为分析外源基因拷贝数提供了新的方法和借鉴。1

材料与方法

1.1

材料与试剂

转基因水稻(Oryzasativa)T1c-19材料由华中农业大学生命科学技术学院提供。转人乳铁蛋白基因(humanlactoferrin,HLF)山羊(Caprahircus)134血液样品由上海杰隆生物科技有限公司提供。DNeasy®PlantMiniKit(QIAGEN,德国)。Quant-iTTMPicoGreen®dsDNAKit(Invitrogen,美国)。ddP-CRMasterMix(Bio-Rad,美国)。DropletGenera-tionOil(Bio-Rad,美国)。DropletReaderOil(Bio-Rad,美国)。1.2

实验仪器

NanodropND-1000核酸蛋白定量仪(Thermo

Scientific，美国)。DY-501型核酸电泳仪(上海精密科学仪器有限公司,上海)。UVPBiodoc-It220凝

胶成像一体机(SpringScientific,美国)。SynergyTM2多功能酶标仪(BioTek,美国)。QX100TMDropletDigitalTMPCR系统(Bio-Rad,美国,包括微滴生成仪和微滴读取仪)。ABI7900定量PCR仪(AppliedBiosystem,美国)。1.3方法

1.3.1DNA提取和纯化

转基因水稻基因组DNAT1c-19使用Qiagen公司生产的DNeasyPlantMiniKit纯化，转HLF基因

羊134血液DNA使用天根公司生产的血液DNA提

取试剂盒纯化，

具体步骤见试剂盒说明书。所得基因组DNA质量通过琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop

ND-1000核酸蛋白定量仪评价纯度，

再通过Quant-iTTM

PicoGreendsDNA试剂盒测定浓度。1.3.2

标准质粒构建

为获得准确的qRT-PCR定量结果，本研究通过构建标准质粒来建立实时荧光定量PCR的标准曲线。利用重叠PCR，将定量分析的外源基因和内标准基因特异性片段连接起来，再连接到pMD-18T载体中，使用热激法转入大肠杆菌(Escherichiacoli)感受态细胞内，涂布平板挑选单克隆菌落，将菌落扩繁培养并取菌液进行PCR鉴定，出现目的条带后测序，比对测序结果无误后，最终获得可用于构建标准曲线的标准质粒。图1为构建的标准质粒示意图。1.3.3

引物和探针

实验中涉及的定性、实时荧光定量PCR扩增

引物和探针通过软件primerexpressv2.0设计，由Invitrogen公司合成，具体序列见表1。其中，转基因水稻T1c-19的外源基因杀虫晶体蛋白基因(in-secticidalcrystalprotein,Cry1C*)(GenBankNo.HM107006)能够编码Bt毒蛋白，使T1c-19具有抗虫特性，外源基因膦丝菌素乙酰转移酶(phosphi-

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