StTPS1基因的克隆与玉米大斑病菌遗传转化体系的建立

发布时间：2018-03-09 09:16

本文选题：玉米大斑病菌　切入点：6-磷酸海藻糖合成酶　出处：《沈阳农业大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：玉米大斑病作为一种重要的玉米叶部病害,近几年在东北地区呈流行高发态势,对玉米的产量造成了重大损失。长期以来,人们对玉米大斑病菌的致病机制研究不够深入,限制了新型防治技术的开发,深入探索玉米大斑病致病机制对防治其发生及流行有重要意义。6-磷酸海藻糖合成酶TTST(Trehalose-6-phosphate synthase 1)在稻瘟菌具有调控菌丝生长与致病力的作用,但玉米大斑病菌StTPS1基因的功能尚未报道。本研究建立了玉米大斑病菌基因敲除技术体系,采用基因敲除技术验证StTPS1基因的功能,并阐明StTPS1基因在玉米大斑病菌生长发育中发挥的作用,进一步深入探讨玉米大斑病菌致病力形成的分子机制。1.利用PCR扩增方法克隆了玉米大斑病菌StTPS1基因。参照稻瘟菌MgTPS1氨基酸序列,采用同源比对的方法找出玉米大斑病菌中StTPS1的同源蛋白,利用PCR扩增方法成功克隆了玉米大斑病菌基因组中对应的同源基因,并命名为StTPS1。该基因全长为2090 bp,包含四个外显子与三个内含子,两端具有非翻译区。根据该基因编码蛋白质的序列与稻瘟菌中MgTPS1基因编码蛋白质的序列之间的高度同源性,可以确定该基可能为玉米大斑病菌中的6-磷酸海藻糖合成酶StTPS1基因。2.采用多种生物信息学分析方法对StTPS1基因编码蛋白质进行了深入地分析,明确了其理化性质和结构等相关信息。分析结果表明:该基因编码517个氨基酸、相对分子质量为58376.29、理论等电点为5.36并且属于不稳定蛋白质与亲水性蛋白质。软件分析表明该基因编码蛋白质中不含有信号肽与跨膜结构,亚细胞定位预测结果分析此蛋白定位于细胞质,含有可被磷酸化的位点暗示该蛋白可被激酶磷酸化发挥作用,不存在糖基化位点。结构域分析表明,该蛋白含有糖苷水解酶家族的结构域,这与稻瘟菌MgTPS1的分析结果相似。系统进化树结果显示,玉米大斑病菌分类地位与稻瘟菌较为接近,表明两者的同源性较高,进化关系较近。因此,推断StTPS1基因与稻瘟菌中TPS1基因功能相似,可能具有代谢调控与引起致病力的作用。3.对玉米大斑病菌StTPS1基因敲除载体进行构建。以pBlueScript克隆载体为基础,将pSilent-1载体中的潮霉素抗性基因经PCR扩增、HindⅢSmaI双酶切后再连接至pBlueScript载体中获得基因敲除骨架载体pBS-HPH。使用高保真酶扩增StTPS1基因上游片段1125 bp和下游片段895 bp分别克隆至基因敲除骨架载体pBS-HPH中,成功构建StTPS1基因敲除载体pBS-StTSS1。4.建立了玉米大斑病菌的遗传化体系和基因敲除体系,获得了疑似玉米大斑病菌StTPS1基因敲除突变体。通过对玉米大斑病菌产孢条件优化,确定了玉米大斑病菌在燕麦琼脂培养基和V8蔬菜汁固体培养基上培养、23℃全黑暗条件下培养14 d时产孢量较多。验证出两种分生孢子的收集的最适方法分别为:吸头刮取方法和震荡培养基法。确定了溶壁酶、崩溃酶和蜗牛酶三种酶在酶解时的比例为1:1:1,在28℃ 80rpm下酶解时间为3至5 h时可释放原生质体数量达到最大。进一步优化了转化方法,经过多次的实验获得疑似玉米大斑病菌StTPS1基因敲除突变体。在进一步验证敲除菌株的准确性及其致病力的变化。5.对玉米大斑病侵染过程中玉米抗性的响应进行了研究。接种玉米大斑病菌菌株SYY1303至感病玉米品种黄早四后,在多个时间点采集叶片,利用前人报道的方法对四种防御关键酶的活性进行了分析。结果证实,接种后防御酶的活性均显著上升,但苯丙氨酸解氨酶的活性是先下降而后上升,与其它种类植物受到病原菌侵染后自身防御酶活性变化的趋势相一致。
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【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S435.131.4

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