KLF2基因甲基化状态与非小细胞肺癌的相关性及其功能的研究

发布时间：2018-03-09 17:01

  本文选题：非小细胞肺癌　切入点：CpG岛　出处：《第三军医大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肺癌仍是世界上致死性最高、最常见的恶性肿瘤之一,而非小细胞肺癌是其主要的类型(约80%)。肺癌每年的新增病例数为180万,占肿瘤发病率的13%,已成为对国民健康造成严重威胁的疾病之一。目前,肺癌绝大多数病例在确诊时已经是晚期,这就意味着治疗方案选择的局限,从而预后较差且5年生存率低。因此,寻找肺癌的新型生物标志物和更好地了解非小细胞肺癌的发生可能在改善肺癌早期诊断,治疗选择和临床预后等方面具有重要的意义。最新的研究中已经阐明,大部分癌症的发生是由于DNA在复制过程发生复制随机错误造成的,但是肺癌的发生发展仍是一个涉及了遗传和环境因素等相互作用的多步过程,其中环境因素更被认为是肺癌发生的主要原因。众所周知,表观遗传学的改变与环境的作用密切相关,此外,表观遗传学的改变普遍是多于基因突变等先天遗传改变的,而且这种变化大多是由于环境的影响造成的,因此它可以反映环境引起的病理变化。同时,肿瘤的发生也与表观遗传学的改变密不可分。肿瘤发生就是众多表观遗传学改变叠加的结果,这种表观遗传学改变的积累使得细胞基因表达水平发生变化,然后进一步影响信号通路导致细胞的恶性转化。DNA甲基化诱导基因的沉默就是一种较为常见的表观遗传调控模式。有研究证实在众多的恶性肿瘤的癌前病变中,存在多个肿瘤抑制基因的Cp G岛高甲基化,证明甲基化状态的改变在癌前病变阶段及肿瘤发生的早期阶段就早已存在。作为肿瘤发生中的一个早期事件,基因Cp G岛的甲基化发生在相应正常细胞形态及功能发生改变之前。可以说,DNA甲基化可以通过表观遗传的方式来调节基因的表达,而这一过程是动态可逆的,这一样来DNA甲基化状态的改变就可以用于监测基因的调节,并作为癌症的早期诊断、预后和治疗应答的生物标志物。枯否样因子2(KLF2)也被称为肺枯否样因子(LKLF),在人肺部的晚期发育中起着重要的作用,这暗示KLF2的功能缺失也可能与肺部的病变相关。同时,KLF2基因在各种癌症组织中通常都表达较低,它可以作为潜在的肿瘤抑制基因维持细胞的正常化。因此,不难看出,KLF2的表达缺失可能是肿瘤发生的驱动因素之一。在对KLF2基因进行生物信息学分析后,我们发现在其基因序列上有一个含有267个CpG位点的Cp G岛,提示该基因的转录可能受到甲基化修饰的影响。因此,本研究将致力于探索KLF2 CpG岛的甲基化改变在非小细胞肺癌中是否参与了该基因的表达调控,为以后进一步将KLF2甲基化状态作为非小细胞肺癌的早期诊断标志物提供线索。方法:1、使用荧光定量PCR技术分析KLF2基因在47对非小细胞肺癌组织和相应正常组织及6个细胞株中的表达情况。2、使用重亚硫酸氢盐测序PCR技术(BSP)探索KLF2在非小细胞肺癌细胞株和正常支气管细胞中的差异甲基化区域,然后用单克隆测序的方法进一步验证该区域的甲基化情况。3、利用去甲基化试剂5-氮杂-2-脱氧胞苷处理非小细胞肺癌细胞株A549、HCC827,使用荧光定量PCR技术分析处理前后KLF2的表达情况。4、使用双荧光素酶报告基因实验证实KLF2基因区域4(+567至+906)的功能和其甲基化后对基因表达的影响。5、使用甲基化特异性PCR技术(MSP)检测非小细胞肺癌组织和相应正常组织中KLF2基因的甲基化状态。6、使用CCK-8细胞增殖试剂盒和细胞克隆形成实验检测敲降或重新表达KLF2后非小细胞肺癌细胞株的生存和克隆形成能力的变化。7、使用流式细胞检测技术来评估敲降或过表达KLF2后对非小细胞肺癌细胞周期分布和细胞凋亡情况的影响。8、使用Western蛋白印迹分析敲降或过表达KLF2后对非小细胞肺癌细胞中p15和p21表达的影响。结果:1、在47对非小细胞肺癌组织中,共有31对(65.96%)癌组织的KLF2表达水平比正常组织的低,且KLF2的表达与非小细胞肺癌的淋巴结转移和TNM分期相关。与正常支气管细胞相比,KLF2在非小细胞肺癌细胞株中表达下调。2、虽然KLF2基因启动子区域在非小细胞肺癌细胞株和正常支气管细胞中不存在差异甲基化情况,但是KLF2基因的区域4在两种细胞间却存在差异甲基化状态。BSP技术的单克隆测序也进一步证实了,非小细胞肺癌细胞株中的KLF2基因区域4甲基化水平远高于正常支气管细胞。3、甲基化酶抑制剂5-甲基-2'-脱氧胞苷处理A549、HCC827细胞株后,KLF2基因表达上调。4、双荧光素酶报告基因实验证实KLF2区域4能促进荧光素酶基因的表达,而当其被甲基化后,则又抑制基因的表达。5、在47例非小细胞肺癌组织中有27例(57.44%)癌组织的KLF2基因区域4是甲基化的,其中的26例肺癌组织KLF2表达水平较配对的正常组织低,说明非小细胞肺癌组织的KLF2区域4高甲基化与KLF2基因的表达下调相关。同时,KLF2区域4的甲基化状态还与非小细胞肺癌的淋巴结转移和TNM分期有关。6、KLF2的过表达可以抑制非小细胞肺癌细胞的增殖和克隆形成;相应的,shRNA干扰掉KLF2的表达后可以促进细胞的增殖和克隆形成。7、KLF2可以使非小细胞肺癌细胞株的细胞周期阻滞在G0/G1期,同时也能促进肺癌细胞的凋亡,敲降KLF2会对细胞起到相反的作用。8、KLF2在非小细胞肺癌细胞株中是通过诱导p15和p21的表达而实现对细胞周期阻滞的。结论:在本研究中,我们发现在非小细胞肺癌的细胞株和组织样品中KLF2表达水平显著降低,同时KLF2在非小细胞肺癌的细胞和组织样品中是甲基化的。此外,KLF2表达下调与大多数非小细胞肺癌组织中的KLF2区域4甲基化相关,而且KLF2区域4的甲基化与非小细胞肺癌的淋巴结转移和TNM分期的晚期相关。此外,KLF2在非小细胞肺癌细胞株中过表达能显著抑制肿瘤细胞活力和克隆形成能力,通过诱导p15和p21的表达将肿瘤细胞阻滞在G0/G1期,并促进肿瘤细胞的凋亡。相比之下,KLF2表达的敲降对SK-MES-1细胞具有相反的作用。我们目前的数据提示了,KLF2蛋白可作为非小细胞肺癌中的肿瘤抑制因子,同时KLF2甲基化状态检测可以作为非小细胞肺癌的早期诊断或预后生物标志物,但仍需要更大的样本量和更进一步的研究来进行评估。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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本文编号：1589429