基于hGFAP启动子的Shp2基因敲除对幼鼠大脑皮质、小脑及脑干结构功能的影响

发布时间：2018-03-15 21:53

  本文选题：Shp2　切入点：条件性基因敲除　出处：《浙江大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景：Shp2对多种神经系统组织器官和细胞类型的发育及功能具有重要调控作用。放射状胶质细胞在中枢神经系统中的重要功能近年来被逐渐发现,目前对于Shp2在放射状胶质细胞中的功能尚不清楚。受人神经胶质纤维酸性蛋白(hGFAP)启动子调控的Cre重组酶表达于放射状胶质细胞中,是放射状胶质细胞条件性基因敲除的有力工具。因此,培育并研究基于hGFAP启动子的Shp2条件性敲除小鼠对于揭示调控中枢神经系统发育和功能的分子机制具有重要意义。研究目的：(1)培育并鉴定基于hGFAP启动子的Shp2条件性基因敲除小鼠(2)观察并研究Shp2条件性敲除对幼鼠生存、生长及躯体感觉运动功能发育的影响(3)研究Shp2条件性敲除对幼鼠大脑皮质、小脑及脑干组织结构的影响并初步探讨相关分子机制研究方法：本研究通过hGFAP-Cre转基因小鼠和Shp2flox/flox基因打靶小鼠交配产生hGFAP-Cre/Shp2flox/flox小鼠,即Shp2条件性敲除小鼠。通过基因鉴定、Real-time PCR、Western blot及免疫组化等方式对Shp2条件性敲除小鼠进行多方面的鉴定。观察记录Shp2条件性敲除小鼠的外观、生存时长、出生后体重及大脑重量增长情况,并通过自主回巢实验、循声运动实验、躯体自主翻正实验及抓杆实验评估Shp2条件性敲除幼鼠的感觉运动功能的发育情况。采用石蜡切片H-E、甲苯胺蓝染色对Shp2条件性敲除小鼠的大脑皮质、小脑及脑干进行组织形态学学观察,并通过免疫组化、免疫荧光对Shp2条件性敲除小鼠大脑皮质细胞增殖、凋亡的情况以及大脑皮质、小脑、脑干神经元细胞、星形胶质细胞的数量的分布情况进行观察。最后本研究通过Western blot实验对Shp2条件性敲除小鼠大脑皮质中Akt,Erk信号通路蛋白的表达情况进行了检测。研究结果：第一部分经hGFAP-Cre小鼠和S hp2flox/flox小鼠交配成功培育出Shp2条件性敲除小鼠。Shp2条件性敲除小鼠在脑组织中检测出敲除特征性序列,且脑组织中Shp2的mRNA、蛋白表达水平显著下降。第二部分Shp2条件性敲除幼鼠体形减小,体重及脑重增长迟滞,寿命缩短。Shp2条件性基因敲除幼鼠自主回巢能力、循声运动能力、自主翻正能力及抓杆能力显著下降。第三部分Shp2条件性基因敲除小鼠大脑皮质面积、厚度减小,大脑皮质神经元减少、星形胶质细胞比例增多、伴有皮质细胞凋亡增加、脑室区细胞增殖下降及Erk信号通路抑制。此外Shp2条件性敲除小鼠的小脑、脑干组织结构产生病理改变。结论：本研究成功培育基于hGFAP启动子的Shp2条件性基因敲除小鼠。研究结果表明放射状胶质细胞中的Shp2对于幼鼠大脑皮质、小脑及脑干的正常结构功能的发育具有重要作用。
[Abstract]:Background: Shp2 plays an important role in regulating the development and function of various nervous system tissues, organs and cell types. The important functions of radial glial cells in the central nervous system have been gradually discovered in recent years. At present, the function of Shp2 in radial glial cells is not clear. The Cre recombinant enzyme regulated by human glial fibrillary acidic protein (GFAP) promoter is expressed in radiative glial cells. Is a powerful tool for radiative glial conditional gene knockout. It is important to cultivate and study Shp2 conditional knockout mice based on hGFAP promoter in order to reveal the molecular mechanism of regulating the development and function of central nervous system. Objective: to cultivate and identify the Shp2 conditionality based on hGFAP promoter. To observe and study the survival of Shp2 conditional knockout on young mice. Effects of growth and somatosensory motor function on the cortical effects of Shp2 conditioned knockout in young rats. The effects of cerebellum and brainstem on the structure of cerebellum and brainstem and preliminary study on the molecular mechanism: in this study, hGFAP-Cre/Shp2flox/flox mice were produced by mating between hGFAP-Cre transgenic mice and Shp2flox/flox gene targeting mice. The Shp2 conditional knockout mice were identified in many ways by means of gene identification and immunohistochemistry. The appearance of Shp2 conditioned knockout mice was observed and recorded, and the survival time of Shp2 conditional knockout mice was observed and recorded. The body weight and brain weight increased after birth, and through the self-homing experiment, the acoustic movement experiment, To evaluate the development of sensorimotor function in Shp2 conditioned knockout mice, somatic autonomic righting test and rod grabbing test were used. H-E paraffin sections and toluidine blue staining were used to treat the cerebral cortex of Shp2 conditioned knockout mice. The histomorphology of cerebellum and brainstem was observed, and the proliferation and apoptosis of cerebral cortex cells and neurons in cerebral cortex, cerebellum and brainstem of Shp2 conditioned knockout mice were observed by immunohistochemistry and immunofluorescence. The distribution of astrocytes was observed. Finally, the expression of Akttnerk signaling pathway protein in the cerebral cortex of Shp2 conditioned knockout mice was detected by Western blot experiment. After mating between hGFAP-Cre mice and S hp2flox/flox mice, Shp2 conditioned knockout mice. Shp2 conditional knockout mice were successfully bred to detect knockout characteristic sequences in brain tissue. In the second part, the body shape of Shp2 conditioned knockout mice was decreased, the body weight and brain weight of the knockout mice were delayed, the life span was shortened. Shp2 conditioned gene knockout mice had the ability to homing autonomously and to follow the sound. In the third part, the area and thickness of cerebral cortex of Shp2 conditioned gene knockout mice decreased, the number of cortical neurons decreased, the proportion of astrocytes increased, and the apoptosis of cortical cells increased. The cell proliferation in the ventricular area decreased and the Erk signaling pathway was inhibited. In addition, the cerebellum of Shp2 conditioned knockout mice was removed. Conclusion: Shp2 conditional gene knockout mice based on hGFAP promoter were successfully cultured in this study. The results showed that Shp2 in radial glia cells affected the cerebral cortex of young rats. The development of normal structure and function of cerebellum and brain stem plays an important role.
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R741

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本文编号：1616975