miR-382靶向Kmt5a基因调控精原细胞增殖的研究

发布时间：2018-03-16 07:14

  本文选题：miR-382　切入点：GC-1　出处：《西北农林科技大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：miRNA是一类具有调控作用的非编码小RNA,它通过与靶基因mRNA的3’UTR区结合调控基因的表达。已有研究表明miR-382参与调控多种细胞的增殖,抑制肿瘤细胞的侵袭。为了探究miR-382对小鼠精原细胞的增殖调控作用,本研究使用生物信息学预测了miR-382-5p的潜在靶基因,并使用双荧光素酶报告系统进行验证;通过转染miR-382-5p的类似物与阻抑物,使用CCK-8与EdU试验检测了mi R-382-5p对小鼠精原细胞的细胞活力与增殖能力的影响;通过RT-qPCR检测了猪睾丸中Kmt5a基因在不同发育阶段与不同细胞类型中的表达情况;使用分子克隆测序与生物信息学分析探究了Kmt5a基因剪接变体的分子结构差异。主要结果如下:1、miR-382-5p的预测靶基因为Kmt5a、Top1,通过双荧光素酶试验证明了Kmt5a是miR-382-5p的一个靶基因,而Top1不是。2、细胞活力与增殖能力检测结果表明,与对照组相比,miR-382-5p mimics在120nmol/L的条件下能降低GC-1 spg细胞的活力13.4%(p0.05),并降低GC-1 spg细胞的增殖能力8.6%(p0.05),而miR-382-5p inhibitor不能显著提高GC-1 spg细胞的活力和增殖能力(p0.05)。3、RT-qPCR与Western Blotting试验表明,miR-382-5p mimics在120 nmol/L的条件下能下调靶基因Kmt5a在GC-1spg细胞中的mRNA相对含量39.8%(p0.05),下调KMT5A蛋白表达量36.5%。4、Kmt5a在7日龄猪睾丸支持细胞中的mRNA表达量显著高于间质细胞和性原细胞(p0.05),在5月龄猪睾丸中相对含量显著高于7日龄与2月龄(p0.05)。5、DNA测序结果表明Kmt5a基因在猪睾丸中存在两个剪接变体,即Kmt5a-X1,Kmt5a-X2,蛋白二维结构分析表明KMT5A-X1缺少N端的PIP(PCNA-interacting motifs)box1。综上所述,本研究发现Kmt5a基因是miR-382-5p的一个靶基因,miR-382-5p能够调控GC-1 spg细胞的增殖。因此,miR-382靶向Kmt5a基因调控小鼠精原细胞的增殖。同时,在不同发育阶段的猪睾丸中,Kmt5a的表达量随着年龄的增加而上升;Kmt5a基因在猪睾丸中存在两个剪接变体,其中剪接变体KMT5A-X1缺少N端的PIP box1。本研究结果丰富了miRNA在精原细胞增殖过程中的调控网络,为进一步解析雄性动物精子发生提供初步的实验依据。
[Abstract]:MiRNA is a kind of non-coding small RNAs that can regulate the expression of genes by binding to the 3UTR region of the target gene mRNA. It has been shown that miR-382 is involved in regulating the proliferation of many kinds of cells. In order to investigate the effect of miR-382 on the proliferation of mouse spermatogonia, we used bioinformatics to predict the potential target gene of miR-382-5p, which was verified by double luciferase report system. The effects of miR-382-5p on the viability and proliferation of mouse spermatogonium cells were detected by CCK-8 and EdU tests. The expression of Kmt5a gene in pig testis was detected by RT-qPCR in different development stages and different cell types. Molecular structural differences of splicing variants of Kmt5a gene were explored by molecular cloning sequencing and bioinformatics analysis. The main results were as follows: 1) the predicted target of Kmt5a gene was Kmt5aTiTop1. It was proved by double luciferase test that Kmt5a was a target gene of miR-382-5p. However, Top1 was not. 2. The results of cell viability and proliferation test showed that, Compared with the control group, miR-382-5p mimics decreased the activity of GC-1 spg cells at 120nmol / L and decreased the proliferative ability of GC-1 spg cells by 8.6p0.05p, while miR-382-5p inhibitor could not significantly improve the viability and proliferation of GC-1 spg cells by RT-qPCR and Western Blotting test. Under the condition of 120 nmol/L, the relative content of mRNA of target gene Kmt5a in GC-1spg cells was down-regulated by 39.8%, and the expression of KMT5A protein was down regulated by 36.5%. The expression of Kmt5a in 7-day-old pig testicular Sertoli cells was significantly higher than that of interstitial cells and sex proto-cells p0.05a, and the expression of KMT5A protein in 5-month-old pigs was significantly higher than that of P0.05A cells. The relative content of Kmt5a in testis was significantly higher than that in 7 days and 2 months of age. The results showed that there were two splicing variants of Kmt5a gene in pig testis. That is, Kmt5a-X1 + Kmt5a-X2, the two-dimensional protein structure analysis shows that KMT5A-X1 lacks N-terminal PIP(PCNA-interacting motifs box1.In conclusion, we found that Kmt5a gene is a target gene of miR-382-5p, miR-382-5p can regulate the proliferation of GC-1 spg cells. Therefore, the Kmt5a gene targeting miR-382 regulates the proliferation of mouse spermatogonia. The expression of Kmt5a gene increased with age in pig testis at different developmental stages. There were two splicing variants of Kmt5a gene in pig testis. The splicing variant KMT5A-X1 lacks N-terminal PIP box1.This study enriches the regulatory network of miRNA in the process of spermatogonia proliferation and provides a preliminary experimental basis for further analysis of spermatogenesis in male animals.
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S814

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本文编号：1618855