报告基因荧光素酶在科研中的应用 南京廖华

发布时间：2016-11-02 11:31

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〖综述·讲座〗

报告基因荧光素酶在科研中的应用

杜彦艳,　单保恩

河北医科大学第四医院科研中心,河北石家庄050011

Reportergeneluciferaseinapplicationofscientificresearch

DUYan-yan,SHANBao-en

ResearchCenter,FourthHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050011,P.R.China【摘要】　目的:总结报告基因荧光素酶在医学研究中的新进展。方法:应用pubmed及CNKI期刊全文数据库,以“报告基因和荧光素酶”为关键词,检索1996-01-2007-12相关文献,共收集文献617篇。纳入标准:1)荧光素酶的生物学特性;2)荧光素酶作为报告基因的应用。根据纳入标准,精选55篇文献,并查看每篇文献后的引文,最后纳入19篇文献进行了综述。结果:荧光素酶是在氧气存在下使底物发光的一类酶,该酶类与底物的结合特异性很强,检出的灵敏度高,因没有激发光的非特异性干扰,信噪比较高,具有其他报告基因不可替代的优势,在基因工程研究中被广泛作为报告基因用于单个细胞、转基因生物、动物和人体基因表达的实时、低光成像,是一种非常实用的研究方法。结论:荧光素酶作为报告基因显示出良好的前景,已成为医学研究领域的重要工具,特别是对推动基因工程研究的发展具有重要作用。

中华肿瘤防治杂志,2009,16(9):715-718

[ABSTRACT]　OBJECTIVE:Toreviewadvancesofreportergeneluciferaseinthenewprogressinthescientificresearch.METH-ODS:Luciferase-relatedliteraturewasretrievedinPubMedandcnkifrom1996.1to2007.12.Keywordswerereportergeneandluciferase,and617articalsweregottogether.Theincludedcrite-ria:1)Luciferasebiologicalcharacteristics.2)Luciferaseapplica-tionasreportergene.Fifty-fivepaperswerefurtherstudied,andofwhichreferenceswerelookedfor.Finally19documentswerere-viewed.RESULTS:Luciferasesareenzymesthatemitlightinthepresenceofoxygenandasubstrate(luciferin),andwhicharehigh-lyspecificandhavehighsensitivity,andintheabsenceofexcitationlight,theyhavenon-specificinterference,sothesignal-noiseratioishigh.Theyhaveirreplaceableadvantagestootherreportergenes.Theyhavebeenwidelyusedforreal-time,low-lightimagingofgeneexpressionincellcultures,individualcells,wholeorgan-isms,andtransgenicorganisms.Itisaverypracticalresearchmethod.CONCLUSION:Luciferaseasareportergenehasshowngoodprospects,ithasyetbecomeanimportanttoolinthescientificresearchfields,andhaspromotedthegeneticengineeringresearchinparticular.

ChinJCancerPrevTreat,2009,16(9):715-718

【关键词】　基因,报告;荧光素酶类;综述文献

[KEYWORDS]　genes,reporter;luciferases;reviewliterature

【中图分类号】　R73-3　　　【文献标识码】　A　　　【文章编号】　1673-5269(2009)09-0715-04

　　报告基因是一种易于检测蛋白质或酶等表达产物的基因。把报告基因的编码序列和基因表达调节序列融合形成嵌合基因,或与其他目的基因融合,在调控序列控制下进行表达,通过报告基因的表达产物来标定

【第一作者简介】　杜彦艳,女,河北正定人,主要从事抗肿瘤中药的研究工作。Tel:86-311-86095290

E-mail:duyanyan9868@hotmail.com

【通讯作者简介】　单保恩,男,河北邯郸人,博士,教授,博士生导师,主要从事肿瘤免疫学和抗肿瘤中药的研究工作。T

目的基因的表达状况。作为报告基因,在遗传选择和

筛选检测方面必须具有以下几个条件:1)已被克隆或全序列已被测定;2)表达产物在受体细胞中不存在,在被转染细胞中无相似的内源性表达产物;3)其表达产物能进行定量测定。在转基因、基因启动子分析以及药物筛选等领域,由于报告基因技术具有灵敏度高、检测方便等特点,已被广泛的应用。

1　荧光素酶的来源和性质

荧光素酶是生物体内催化荧光素(luciferin)或脂肪醛(fireflyaldehyde)氧化发光的一类酶的总称,来

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杜彦艳,等　报告基因荧光素酶在科研中的应用

同,可将荧光素酶分为萤火虫荧光素酶(fireflylucifer-ase,FL)和细菌荧光素酶(bacterialluciferase,

[1]BL)。细菌荧光素酶对热敏感,因此在哺乳细胞的

在研究非甾体抗炎药(NSAIDs)塞来考昔的抗结肠癌

作用机制时发现,它可以通过抑制Survivin基因的表达,诱导结肠癌细胞的凋亡。进一步通过PCR方法将Survivin基因启动子相对于5′起始密码子上游的-1594/-18bp区从人类基因组DNA中扩增出来,亚克隆到萤火虫荧光素酶报告载体(pGL3-Basic),合成pGL3-1594(-1594/-18bp)质粒;再通过PCR方法从pGL3-1594(-1594/-18bp)质粒中得到一系列包含Survivin不同长度启动子的质粒(-418/-18、-326/-18、-211/-18、-75/-18、-65/-18、-55/-18、-45/-18和-34/-18bp),将这些质粒分别转染结肠癌细胞18h后,用塞来考昔作用24h,通过监测荧光素酶的活性来了解Survivin的表达情况。结果发现,塞来考昔可明显降低Sur-vivin的表达、诱导肿瘤细胞凋亡,其作用是通过抑制Survivin基因启动子中相对于起始密码子-75/-66bp区的转录活性起作用的。

Jiang等

[7]

应用中受到限制。目前,以北美萤火虫(NorthA-mericafirefly)来源的荧光素酶基因应用的最为广泛,该基因可编码产生550个氨基酸的荧光素酶蛋白[3]。近年来,在深海中又发现了海洋腔肠荧光素酶,它所催化的底物海洋腔肠荧光素具有膜通透性,且在哺乳动物细胞中无内源性活力,是保持活细胞完整性最佳的报告基因

[4]

[2]

。

2　荧光素酶的发光机制

生物荧光实质是一种化学荧光[3]。BL以脂肪醛(RCHO)为底物,在还原型黄素单核苷酸(FMNH2)及氧的参与下,使脂肪醛在被氧化为脂肪酸的同时放出光子,产生490nm的荧光

RCHO+O2+FMNH2　BL

[1]

,其化学反应式如下。

※　RCOOH+H2O+FMN+光

2+

　　FL基因来自萤火虫,在Mg、ATP、O2的参与

用Luciferase法检测胃癌细胞

下,催化D-荧光素(D-luciferin)氧化脱羧,产生激活态的氧化荧光素,并放出光子,产生550～580nm的荧光[1],其化学反应式如下。

D-荧光素+ATP+O2

FL、Mg

2+

BGC-823端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子转录活性

时发现,转染hTERT启动子基因的细胞用多西紫杉醇作用0、6、12、24、36和48h后,随着作用时间的延长,Luc/β-gal值逐渐减小,表现出时间依赖性的抑制作用,表明多西紫杉醇抑制端粒酶及其亚基基因的表达是对hTERT启动子活性抑制作用的可能机制之一。

4.2　荧光素酶基因标记细胞

报告基因技术已被广泛应用于体外监测细胞生长和增殖,以及与基因表达和信号转导有关的细胞活动。理论上,机体内任何一种细胞(尤其是癌细胞、造血细胞、干细胞等)在体外(如基因转染)或体内(如直接注射)标记上荧光素酶后,都可以通过闪烁计数器或分子成像技术进行定量或体内跟踪,以了解细胞的增殖反应强度以及其在体内生长转移规律,或利用细胞(主要是免疫细胞)进行生物治疗等。Ozawa等[8]在研究骨髓间充质干细胞(MSCs)对不同疾病的细胞和基因治疗中,通过遗传修饰MSCs,使它产生编码单纯疱疹病毒胸苷激酶的逆转录病毒载体,即VP-MSCs,从而增强全身性癌基因杀伤疗法(systemicsuicidecancergenetherapy)的治疗效果。为了评估MSCs的肿瘤趋向性,用荧光素酶分别标记MSCs和VP-MSCs,于左心室注射神经胶质瘤细胞9L的荷瘤裸鼠后,用活体内成像分析表明,转基因在裸鼠9L皮下肿瘤内积聚,并且VP-MSCs比MSCs产生更强的生物荧光信号,说明VP-MSCs的疗效更佳,为MSCs对不同疾病的细胞和基因治疗效果观察提供了更科学的依据。

[2]

※氧化荧光素

+CO2+AMP+Pi+光

　　这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光,其组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白(GFP)。荧光素

酶是靠酶和底物的相互反应发光,特异性很强,灵敏度高,由于没有激发光的非特异性干扰,信噪比也比较高。

3　荧光素酶的检测方法

依赖生物发光特性,利用闪烁计数器(scintillationcounter)对荧光素酶的活性作出定量检测[5]。在标准反应条件下,加入超量底物,经一定时间内,荧光闪烁总数与样品中存在荧光素酶的活性成正比。另外,也可以采用光自显影法对荧光素酶进行定性检测[4]。

4　应用

荧光素酶基因可用于标记基因、细胞和活体动物。标记方法是通过分子生物学克隆技术,将荧光素酶基因插到预期分析的细胞染色体内,通过单克隆细胞技术的筛选,培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株。由于现代化实验仪器可以检测到10-19mol的荧光素酶,所以应用该方法的灵敏度很高。

4.1　荧光素酶基因标记基因

荧光素酶基因插入不同基因启动子(promoter)之后,成为该基因表达的报告基因,通过监测报告基因可[6]

将荧光素酶基因标记微生物后,可以对标记有荧光素酶的微生物(如腺病毒、细菌等)进行示踪,了解他们在机体内的传播规律以及药物对他们的作用。因为死的微生物不能表达报告基因,所以可以通过观察报告基因的消失来判断药物疗效。这个快速发展的领域将会更加有助于在不同水平深入了解宿主-微生物的相互作用。Saeij等

[9]

、、反应速度、监测灵敏度、线性范围和仪器需要等要求,使用标准的手工荧光照度仪可在30s内完成测试。目前,这套系统已开始商品化。Parsons等在同时评价药物在两种不同G蛋白偶联受体亚型的活性时使用双荧光素酶报告基因系统,分别构建了转染人促肾上腺皮质激素释放激素1(hCRH1)受体和萤火虫荧光素酶报告基因或hCRH2和海肾荧光素酶报告基因的稳定细胞系,这些细胞系可以分别提供针对CRH1和CRH2受体不同的荧光素酶计数;而且在接受不同刺激后,可以在96孔板中直接进行高通量荧光素酶发光测定。结果显示,非选择性CRH拮抗剂可以阻断增效剂诱导的CRH1和CRH2受体荧光素酶的增加,而选择性CRH1拮抗剂仅阻断特异性CRH1增效剂蛙皮降压肽诱导的CRH1受体荧光素酶的增加。这些数据提示CRH1和CRH2受体的不同药理学特性。这种方法也使在同一块96孔板中同时研究两种受体亚型成为可能。为双荧光报告系统用于基础研究和复合物筛选提供了依据。

[14]

[15]

用荧光素酶分别标记两种不同

菌种S22和S23的鼠弓形体并且感染小鼠,发现它们在小鼠体内具有不同的繁殖、播散和再活化特点。为研究病原微生物感染进程、发病机制和宿主对疾病的反应提供了新的思路。4.4　活体生物体内成像

活体动物生物发光的检测,需要一套活体成像系统,它是由一个高度灵敏的冷CCD(charge-coupleddevice)相机,特别设计的成像暗箱和成像软件组成。成像软件可以分析、组织和储存数据。

荧光素酶基因(LUC)标记的基因、细胞和动物,使科研人员能够通过活体生物体成像系统直接监控生物体内的细胞活动和基因行为。特别是在各种类型的肿瘤研究中,能够直接快速地测量各种肿瘤动物模型中肿瘤细胞的生长和转移状态,并可对治疗中肿瘤细胞的变化进行实时观测和评估。能够无创伤对动物整体的原位瘤、转移瘤及自发瘤进行检测及计量,即使微小的迁移也能被检出[10-11]。传统的动物实验方法需要在不同时间点宰杀实验动物以获得数据,得到多个时间点的实验结果。相比之下,体内可见光成像通过对同一组实验对象在不同时间点进行记录,跟踪同一观察目标(标记细胞及基因)的移动及变化,由于能够对同一动物进行连续检测,在最大程度上减少了不同实验动物之间的个体差异以及传统检测方法的误差所造成的对实验结果的影响,更重要的是活体生物萤光成像技术的敏感性极高。Edinger等

[12]

图1　生物发光成像体外显示大鼠肿瘤以及大组织标本

A:大鼠体外肿瘤的位置;B:处死大鼠后解剖所示肿瘤位置

4.6　药物筛选

近年来,细胞因子作为新药研究和开发逐渐成为研究热点。由于有机小分子化合物具有高效、安全、成本低和稳定等优点,通过高效和特异的筛药模型筛选有机小分子化合物成为新药研制领域的一项重要课题。随着基因组及蛋白组学研究的不断进展,为新药研究提供了大量靶标,而在靶标的分子生物学研究取得的成果使得对靶标基因表达更精确、更敏感、更微观调控元件的研究成为可能[16]。荧光素酶则满足了药物筛选的特异靶点、高敏感性、高通量的要求[17]。Tian等进行的新药筛选工作就是基于造血生长因子及其受体JAK-STAT信号转导,以人工合成的4个拷贝的STAT结合序列为调控序列,以荧光素酶基因为报告基因,将构建的表达载体导入转染粒细胞集落刺激因子(G-CSF)受体的4B6细胞中。利用此细胞进行筛选发现了一个有机小分子SB247464,该分-,[18]

报道,活体生物

萤光成像技术检测肿瘤细胞的敏感性甚至超过了流式

细胞仪。Zeamari等[13]用非侵袭性生物发光成像系统监测转染了荧光素酶的CC531结肠癌细胞在WAG/RIJD大鼠腹腔的增长情况,结果显示,检测到的发光信号与处死动物后解剖观察腹膜腔而得到的对肿瘤鉴定具有很好的相关性(图1),为科研工作者使用活体生物体内成像技术提供了依据。

4.5　双荧光报告系统

理想的双报告基因方法使研究者能够以萤火虫荧光素酶所具有的速度、灵敏度和线性范围对同一样品中的两个报告基因同时测定,这在传统的报告基因如

(CAT)、β-半乳糖苷酶(β-Gal)萄糖醛酸糖苷酶GUS)等均由于其测试化学、求等所固有的局限性是不可能达到的。随着对海洋腔,

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杜彦艳,等　报告基因荧光素酶在科研中的应用

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[14]　薛丽香,童坦君,张宗玉,等.报告基因的选择及其研究趋向[J].

因表达。避免了有机大分子类药物不宜口服、毒性较

大等缺点,并且可以SB247464为先导化合,经过组合化学方法的改造完善其结构,易得到高活性的有机小分子化合物。

Ashutosh等[19]构建了表达荧光素酶基因的杜利氏曼原虫模型,从而可以实现体外抗杜利氏曼原虫的高通量药物筛选,弥补了过去抗杜利氏曼原虫药物筛选技术方法费时、费力和难于定量检测的不足。这种方法为科研工作者使用荧光素酶进行高通量药物筛选提供了依据。

5　展望

随着报告基因技术的发展、检测方法的改进以及更多无毒害报告基因的发现,相信在不远的将来,报告基因技术也将会作为新技术用于临床实践,扩展到临床检验及药物治疗等领域,服务于人类的医疗卫生事业。

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2005,

收稿日期:2008-10-30　修回日期:2009-02-05

(编辑:史本玲)

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本文编号：161935