报告基因荧光素酶在科研中的应用

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中华肿瘤防治杂志 2009 年 5 月第 16 卷第 9 期 　　CH IN J CA N CE R PREV T REA T , M ay 2009 , V ol . 16 　N o. 9

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〖 综述 · 讲座〗

报告基因荧光素酶在科研中的应用
杜彦艳 , 　单保恩
河北医科大学

第四医院科研中心 , 河北 石家庄 050011

Reporter gene luciferase in application of scientific research
DU Y an-y an , S H AN Bao-en Research Center , Fourth Hospital o f Hebei Medical University , S hijiazhuang 050011 , P . R. China 【 摘要】　目 的 : 总 结报 告基 因 荧光 素酶 在 医学 研究中的新进 展 。 方 法 : 应用 pubmed 及 CNK I 期刊全文 数据库 , 以“ 报 告基 因和 荧 光 素 酶 ” 为 关 键 词 , 检 索 1996 -01 2007 -12相关文 献 , 共 收集 文献 617 篇 。 纳 入标 准 : 1) 荧光素酶 的生物学特 性 ; 2) 荧光 素酶 作 为 报 告 基 因 的 应 用 。 根 据 纳 入 标 准 , 精选 55 篇 文献 , 并查 看 每篇 文 献后 的 引文 , 最后纳入 19 篇文 献进 行了综 述 。 结 果: 荧 光素 酶是 在氧 气 存在 下使 底物 发光 的 一类 酶 , 该酶 类与 底 物的 结合 特异 性很 强 , 检出的灵敏度 高 , 因 没有激 发光的 非特 异性 干扰 , 信噪比 较高 , 具有其 他报告 基因 不 可替 代的 优势 , 在 基 因工 程研 究中 被广 泛 作为 报告 基因 用于 单个 细胞 、 转基 因生 物 、动物 和 人 体 基 因表 达 的 实 时 、 低 光 成 像 , 是一种非常 实用的 研究 方法 。 结 论 : 荧 光素酶作为报告基因显示出良 好的前景 , 已 成为医学研究领域的重要工具 , 特别是对推 动基因工程研究的发展具有重要作用 。
中华肿瘤防治杂志 , 2009 , 16( 9) : 715 -718

[ ABSTRACT] 　OBJECTIVE: T o review adv ances of repor te r gene lucife rase in the new pro g ress in the scientific research .METH ODS :L ucife rase -rela ted litera tur e was re trieved in PubM ed and cnki fro m 1996 . 1 to 2007 . 12 .K ey wo rds w ere repor ter gene and lucife rase , and 617 ar ticals were go t toge ther .T he included c riteria : 1) L ucife rase biolog ical cha racteristics .2) L ucife rase applicatio n as repo rter g ene . F ifty-five paper s we re fur the r studied , a nd o f w hich references w ere looked for .Finally 19 do cuments wer e reviewed . RESULTS:Luciferases ar e enzy mes that emit ligh t in the presence o f ox yg en and a substra te ( luciferin), and which are highly specific and hav e hig h sensitivity , and in the absence o f e xcitation lig ht , they have non-specific interfere nce , so the sig nal-no ise ratio is high . T hey have irreplaceable advantages to other repo rter g enes .T hey hav e been w ide ly used for real - time , lo w-lig ht imaging o f gene e xpression in ce ll culture s , individua l cells , who le o rganisms , a nd transgenic o rg anism s . It is a v ery practical research method . CONCLUSION :Lucifer ase as a repor ter ge ne has show n g oo d pro spects , it has y et become an impo rtant to ol in the scie ntific resea rch fields , and has promo ted the g ene tic engineering research in par ticular .
Chin J Cancer P rev Treat , 2009 , 16( 9) : 715 -718

【 关键词】　基因 , 报告 ; 荧光素酶类 ; 综述文献 [ KEYWORDS ] 　g enes , repor te r ; luciferases ;review lite rature 【 中图分类号】　R73 -3 　　　【 文献标识码】 　A 　　　【 文章编号】　1673 -5269( 2009) 09 -0715 -04

　　报告基因是一种易于检测蛋白质或酶等表达产物 的基因 。 把报告基因的编码序列和基因表达调节序列 融合形成嵌合基因 , 或与其他目的基因融合 , 在调控序 列控制下进行表达 , 通过报告基因的表达产物来标定
【 第一作者简介】　杜彦艳 , 女 , 河北正定人 , 主要 从事抗肿瘤 中 药的研究工作 。 T el :86 -311 -86095290 E -mail :duyanya n9868 @hotmail . co m 【 通讯作者简介】　单保恩 , 男 , 河北邯郸人 , 博士 , 教授 , 博士 生 导师 , 主要从事肿瘤免疫学和抗肿瘤中药的研 究工作 。 T el : 86 -311 -86095283 　E-mail : baoenshan @yahoo . com . cn

目的基因的表达状况 。 作为报告基因 , 在遗传选择和 筛选检测方面必须具有以下几个条件 : 1) 已被克隆或 全序列已被测定 ; 2) 表达产物在受体细胞中不存在 , 在 被转染细胞中无相似的内源性表达产物 ; 3) 其表达产 物能进行定量测定 。 在转基因 、基因启动子分析以及 药物筛选等领域 , 由于报告基因技术具有灵敏度高 、 检 测方便等特点 , 已被广泛的应用 。

1 　荧光素酶的来源和性质
荧光素酶是生物体内催化荧光素( lucif erin) 或脂 肪醛( fi ref ly aldehyde) 氧化发光的一类酶的总 称 , 来 自于自然界能够发光的生物 。 根据来源生物种类的不

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杜彦艳 , 等 　报告基因荧光素酶在科研中的应用

同 , 可将荧光素酶分为萤火虫荧光素酶( fi ref ly lucif erase , F L )和 细 菌 荧 光 素 酶 ( bacte rial lucif erase ,
[ 1] BL) 。 细菌荧光素酶对热敏感 , 因此在哺乳细胞的

在研究非甾体抗炎药( NSAIDs) 塞来考昔的抗结肠癌 作用机制时发现 , 它可以通过抑制 Survivin 基因的表 达 , 诱导结肠癌细胞的凋亡 。 进一步通过 PCR 方法将 S urvivi n 基 因 启动 子 相对 于 5′ 起 始 密 码 子上 游 的 1 594/ 18 bp 区从人类基因组 DNA 中扩增出来 , 亚克隆到萤火虫荧光素酶报告载体 ( pG L3-Basic) ,合 成 pG L3-1594( -1 594/ 18 bp) 质粒 ; 再通过 PC R 方 法从 pGL3-1594( -1 594/ -18 bp) 质粒中得到一系 列 包 含 Survivin 不 同 长 度 启 动 子 的 质 粒 ( 418/ -18 、-326/ -18 、-211/ -18 、 -75/ -18 、 65/ 18 、55/ -18 、-45/ 18 和 -34/ -18 bp ) , 将这些质粒分别转染结肠癌细胞 18 h 后 , 用塞来考昔 作用 24 h , 通过监测荧光素酶的活性来了解 Survivin 的表达情况 。 结果发 现 , 塞来考 昔可明 显降 低 Survivi n 的表达 、诱导肿瘤细胞凋亡 , 其作用是通过抑制 S urvivi n 基 因 启 动 子 中 相 对 于 起 始 密 码 子 75/ 66 bp区的转录活性起作用的 。 Jiang 等
[ 7]

应用中受到限制 。 目前 , 以 北美萤火虫 ( No rth Am erica fi ref ly ) 来源的荧光素酶基因应用的最为广泛 , 该基因可编码产生 550 个氨基酸的荧光素酶蛋白[ 3] 。 近年来 , 在深海中又发现了海洋腔肠荧光素酶 , 它所催 化的底物海洋腔肠荧光素具有膜通透性 , 且在哺乳动 物细胞中无内源性活力 , 是保持活细胞完整性最佳的 报告基因
[ 4]

[ 2]

。

2 　荧光素酶的发光机制
生物荧光实质是一种化学荧光[ 3] 。 BL 以脂肪醛 ( RCH O) 为底物 , 在还原型黄素单核苷酸 ( F M NH 2) 及氧的参与下 , 使脂肪醛在被氧化为脂肪酸的同时放 出光子 , 产生 490 nm 的荧光
RCHO +O2 +F M N H 2 　 BL
[ 1]

, 其化学反应式如下 。

※ 　RCO O H +H 2 O +F M N +光
2+

　　F L 基因来自萤火虫 , 在 M g

、AT P 、O2 的参与

用 Lucif erase 法 检 测 胃 癌 细 胞

下 , 催化 D-荧光素( D-lucif eri n) 氧化脱羧 , 产生激活态 的氧化荧光素 , 并放出光子 , 产生 550 ～ 580 nm 的荧 光[ 1] , 其化学反应式如下 。
Mg D -荧光素 + AT P + O2 F L 、
2+

BGC-823端粒酶逆转录酶 ( hT ERT ) 启 动子转录活性 时发现 , 转染 h T ERT 启动子基因的细胞用多西紫杉 醇作用 0 、 6 、12 、24 、36 和 48 h 后 , 随着作用时间的延 长 , Luc/β-gal 值逐渐减小 , 表现出时间依赖性的抑制 作用 , 表明多西紫杉醇抑制端粒酶及其亚基基因的表 达是对 hT ERT 启 动 子 活 性 抑 制 作用 的 可 能 机 制 之一 。 4. 2 　荧光素酶基因标记细胞 报告基因技术已被广泛应用于体外监测细胞生长 和增殖 , 以及与基 因表达和 信号转导 有关的细 胞活 动 。 理论上 , 机体内任何一种细胞 ( 尤其是癌细胞 、 造血细胞 、 干细胞等) 在体外( 如基因转染 ) 或体内( 如 直接注射) 标记上荧光素酶后 , 都可以通过闪烁计数器 或分子成像技术进行定量或体内跟踪 , 以了解细胞的 增殖反应强度以及其在体内生长转移规律 , 或利用细 胞( 主要是免疫细胞) 进行生物治疗等 。 Ozawa 等[ 8] 在 研究骨髓间充质干细胞 ( MSCs) 对不同疾病的细胞和 基因治疗中 , 通过遗传修饰 M SC s , 使它产生编码单纯 疱疹病毒胸苷激酶的逆转录病毒载体 , 即 VP-MSCs , 从而增强 全 身性 癌 基因 杀 伤疗 法 ( sy stemic suicide cancer gene therapy ) 的治疗效果 。 为了评估 MSCs 的 肿瘤 趋 向 性 , 用 荧 光 素 酶 分 别 标 记 M SC s 和 VPMSCs , 于左心室注射神经胶质瘤细胞 9L 的荷瘤裸鼠 后 , 用活体内成像分析表明 , 转基因在裸鼠 9L 皮下肿 瘤内积聚 , 并且 VP-MSCs 比 M SCs 产生更强的生物 荧光信号 , 说明 VP-M SCs 的疗效更佳 , 为 MSCs 对不 同疾病的细胞和基因治疗效果观察提 供了更科学的 依据 。 4. 3 　荧光素酶基因标记微生物
[ 2]

※

氧化 荧光素 +CO 2 +A M P +Pi +光

　　这种无需激发光就可发出偏红色的生物荧光 , 其 组织穿透能力明显强于绿色荧光蛋白( GF P) 。 荧光素 酶是靠酶和底物的相互反应发光 , 特异性很强 , 灵敏度 高 , 由于 没有 激 发光 的非 特 异性 干 扰 , 信 噪 比也 比 较高 。

3 　荧光素酶的检测方法
依赖生物发光特性 , 利用闪烁计数器( scintill ation [ 5] counter) 对荧光素酶的活性作出定量检测 。 在标准 反应条件下 , 加入超量底物 , 经一定时间内 , 荧光闪烁 总数与样品中存在荧光素酶的活性成正比 。 另外 , 也 可以采用光自显影法对荧光素酶进行定性检测[ 4] 。

4 　应用
荧光素酶基因可用于标记基因 、 细胞和活体动物 。 标记方法是通过分子生物学克隆技术 , 将荧光素酶基 因插到预期分析的细胞染色体内 , 通过单克隆细胞技 术的筛选 , 培养出能稳定表达荧光素酶的细胞株 。 由 于现代化实验仪器可以检测到 10 -19 mol 的荧光素酶 , 所以应用该方法的灵敏度很高 。 4. 1 　荧光素酶基因标记基因 荧光素酶基因插入不同基因启动子( prom ot er) 之 后 , 成为该基因表达的报告基因 , 通过监测报告基因可 实现对目标基因表达的监测 。 Sakoguchi-Okada 等
[ 6]

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将荧光素酶基因标记微生物后 , 可以对标记有荧 光素酶的微生物( 如腺病毒 、 细菌等) 进行示踪 , 了解他 们在机体内的传播规律以及药物对他们的作用 。 因为 死的微生物不能表达报告基因 , 所以可以通过观察报 告基因的消失来判断药物疗效 。 这个快速发展的领域 将会更加有助于在不同水平深入了解宿主-微生物的 相互作用 。 Saeij 等
[ 9]

酶可以满足如兼容化学特性 、操作条件 、 反应速度 、监 测灵敏度 、 线性范围和仪器需要等要求 , 使用标准的手 工荧光照度仪可在 30 s 内完成测试 。 目前 , 这套系统 已开始商品化 。 P arso ns 等 在同时评价 药物在 两种不同 G 蛋白偶联受体亚型的活性时使用双荧光 素酶报告基因系统 , 分别构建了转染人促肾上腺皮质 激素释放激素 1( hC RH1) 受体和萤火虫荧光素酶报告 基因或 hC RH 2 和海肾荧光素酶报告基因的稳定细胞 系 , 这些细胞系可以分别提供针对 C RH 1 和 CRH 2 受 体不同的荧光素酶计数 ; 而且在接受不同刺激后 , 可以 在 96 孔板中直接进行高通量荧光素酶发光测定 。 结 果显示 , 非选择性 C RH 拮抗剂可以阻断增效剂诱导 的 CRH 1 和 C RH 2 受 体荧光素酶的 增加 , 而 选择性 C RH 1 拮抗剂仅阻断特异性 C RH1 增效剂蛙皮降压 肽诱导的 C RH 1 受体荧光素酶的增 加 。 这些数据提 示 CRH 1 和 CRH 2 受体的不同药理学特性 。 这种方 法也使在同一块 96 孔板中同时研究两种受体亚型成 为可能 。 为双荧光报告系统用于基础研究和复合物筛 选提供了依据 。
[ 14] [ 15]

用荧 光素酶分别标记两种不同

菌种 S22 和 S23 的鼠弓形体并且感染小鼠 , 发现它们 在小鼠体内具有不同的繁殖 、播散和再活化特点 。 为 研究病原微生物感染进程 、 发病机制和宿主对疾病的 反应提供了新的思路 。 4. 4 　活体生物体内成像 活体动物生物发光的检测 , 需要一套活体成像系 统 , 它是 由一 个 高度 灵 敏的 冷 CCD ( charge-coupled device) 相机 , 特别设计的成像暗箱和成像 软件组成 。 成像软件可以分析 、组织和储存数据 。 荧光素酶基因 ( L UC ) 标记的 基因 、细胞 和动物 , 使科研人员能够通过活体生物体成像系统直接监控生 物体内的细胞活动和基因行为 。 特别是在各种类型的 肿瘤研究中 , 能够直接快速地测量各种肿瘤动物模型 中肿瘤细胞的生长和转移状态 , 并可对治疗中肿瘤细 胞的变化进行实时观测和评估 。 能够无创伤对动物整 体的原位瘤 、 转移瘤及自发瘤进行检测及计量 , 即使微 小的迁移也能被检出[ 10-11] 。 传统的动物实验方法需要 在不同时间点宰杀实验动物以获得数据 , 得到多个时 间点的实验结果 。 相比之下 , 体内可见光成像通过对 同一组实验对象在不同时间点进行记录 , 跟踪同一观 察目标( 标记细胞及基因) 的移动及变化 , 由于能够对 同一动物进行连续检测 , 在最大程度上减少了不同实 验动物之间的个体差异以及传统检测方法的误差所造 成的对实验结果的影响 , 更重要的是活体生物萤光成 像技术的敏感性极高 。 Edinger 等
[ 12]

图 1 　生物发光成像体外显示大鼠肿瘤以及大组织标本
A: 大鼠体外肿瘤的位置 ; B: 处死大鼠后解剖所示肿瘤位置

4. 6 　药物筛选 近年来 , 细胞因子作为新药研究和开发逐渐成为 研究热点 。 由于有机小分子化合物具有高效 、 安全 、 成 本低和稳定等优点 , 通过高效和特异的筛药模型筛选 有机小分子化合物成为新药研制领域 的一项重要课 题 。 随着基因组及蛋白组学研究的不断进展 , 为新药 研究提供了大量靶标 , 而在靶标的分子生物学研究取 得的成果使得对靶标基因表达更精确 、更敏感 、 更微观 [ 16] 调控元件的研究成为可能 。 荧光素酶则满足了药 物筛选的特异靶点 、高敏感性 、 高通量的要求[ 17] 。 T ian 等 进行的新药筛选工作就是基于造血生 长因子及其受体 JA K-ST A T 信号转导 , 以人工合成的 4 个拷贝的 ST A T 结合序列为调控序列 , 以荧光素酶 基因为报告基因 , 将构建的表达载体导入转染粒细胞 集落刺激因子( G-CSF) 受体的 4B6 细胞中 。 利用此细 胞进行筛选发现了一个有机小分子 SB 247464 , 该分 子在 4B6 细胞中能够同 G-CSF 一样 , 启动荧光素酶基
[ 18]

报道 , 活体生物

萤光成像技术检测肿瘤细胞的敏感性甚至超过了流式 细胞仪 。 Z eama ri 等[ 13] 用非侵袭性生物发光成像系统 监测转染了荧光素酶的 CC531 结肠癌细胞在 WAG / RIJD 大鼠腹腔的增长情况 , 结果显示 , 检测到的发光 信号与处死动物后解剖观察腹膜腔而得到的对肿瘤鉴 定具有很好的相关性 ( 图 1) , 为科研工作者使用活体 生物体内成像技术提供了依据 。 4. 5 　双荧光报告系统 理想的双报告基因方法使研究者能够以萤火虫荧 光素酶所具有的速度 、灵敏度和线性范围对同一样品 中的两个报告基因同时测定 , 这在传统的报告基因如 氯霉素乙酰转移酶( CA T) 、 β-半乳糖苷酶 ( β-Gal) 和葡 萄糖醛酸糖苷酶 ( G US) 等均由于其测试化学 、 处理要 求等所固有的局限性是不可能达到的 。 随着对海洋腔 肠荧光素酶的发现 , 结合萤火虫和海洋腔肠双荧光素

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杜彦艳 , 等 　报告基因荧光素酶在科研中的应用 [ 8] 　O zaw a K , Sato K , O h I , et al . Cell and gene t herapy using m esenchym al s tem cel ls ( M SCs)[ J] . J Au t oim mun , 2008 , 30( 3) : 121-127 . [ 9] 　 S aeij J P , Boyl e J P , G ri gg M E , et al . Biolumi nes cen ce i magin g of T oxoplasma gondii inf ect ion i n living mice reveals dramatic di ff erences betw een st rai ns[ J] . Inf ect Immun , 2005 , 73( 2) : 695 702. [ 10] 　Jen ki ns D E , Oei Y , Hornig Y S , et al . Biolumi nes cen t i magin g ( BLI) t o imp rove and ref ine t radit ional murin e models of tum or g row t h and m et ast asi s[ J] . C lin Ex p M etas tasis , 2003 , 20( 8) : 773-744 . [ 11] 　Bhaumik S , G amb hir S S . O p tical im aging of Renill a lu cif erase report er gene exp res si on in living mi ce[ J] . Proc N atl A cad Sci US A , 2002 , 99( 1) : 377-382 . [ 12] 　Edi nger M , C ao Y A , V erneri s M R , et al . Revealing lymph oma g row t h and the eff icacy of imm une cell t herapies using i n vivo bi ol uminescence im aging[ J] . Blood , 2003 , 101( 2) : 640 -648 . [ 13] 　Zeamari S , Rumpi ng G , Floot B , et al . In vivo biolu minescence im aging of locally dis semi nat ed col on carci noma in rat s[ J] . Br J Cancer , 2004 , 90 : 1259-1264 . [ 14] 　薛丽香 , 童坦君 , 张宗玉 , 等 . 报告基因的选择及其研究趋向[ J] .

因表达 。 避免了有机大分子类药物不宜口服 、 毒性较 大等缺点 , 并且可以 SB247464 为先导化合 , 经过组合 化学方法的改造完善其结构 , 易得到高活性的有机小 分子化合物 。 Ashuto sh 等[ 19] 构建了表达荧光素酶基因的杜利 氏曼原虫模型 , 从而可以实现体外抗杜利氏曼原虫的 高通量药物筛选 , 弥补了过去抗杜利氏曼原虫药物筛 选技术方法费时 、 费力和难于定量检测的不足 。 这种 方法为科研工作者使用荧光素酶进行高通量药物筛选 提供了依据 。

5 　展望
随着报告基因技术的发展 、检测方法的改进以及 更多无毒害报告基因的发现 , 相信在不远的将来 , 报告 基因技术也将会作为新技术用于临床实践 , 扩展到临 床检验及药 物治疗等 领域 , 服务于人 类的医疗 卫生 事业 。

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收稿日期 : 2008 -10 -30 　修回日期 : 2009 -02 -05 ( 编辑 : 史本玲)



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