丹参抗性基因SmERF1的功能研究

发布时间：2018-03-16 14:22

本文选题：AP2/ERF　切入点：丹参　出处：《陕西师范大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：植物AP2/ERF家族是一个庞大的植物转录因子超家族,广泛存在于植物中。该家族蛋白均含有1或2个由60-70个氨基酸组成的高度保守的AP2结构域,广泛参与植物生长发育、衰老、抗性、代谢等众多生物学过程。丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)为唇形科(Labiatae)鼠尾草属多年生草本药用植物。具有抗血栓、消炎、抗病毒、抗肿瘤、镇痛等作用,在临床上被广泛用于心脑血管疾病的治疗。丹参作为一种重要的药用模式植物,目前关于其转录因子的研究较少,众多转录因子,尤其是ERF基因家族成员的功能尚不明了。在实验室数字表达谱筛选的基础上,本研究克隆并分析了一条ERF转录因子基因SmERF1 (unigene46389),通过超表达该基因,对其在丹参生长发育、胁迫响应、次生代谢调控等方面的生物学功能做了初步研究。本研究的主要内容与结果如下：1.依据本实验室丹参转录组数据库基因序列(unigene46389),通过PCR扩增从丹参中克隆得到了SmERF1基因,该基因含有一个长度为549 bp开放阅读框,编码182个氨基酸,含有一个由63个氨基酸组成的保守的AP2结构域,三级结构中含有3个反向平行的p折叠和一个几乎与之相平行的α螺旋,并且其AP2结构域中第14、19位的氨基酸残基分别是丙氨酸和天冬氨酸,属于典型的AP2/ERF家族中的ERF家族成员。实时定量PCR结果表明,SmERF1的表达受到茉莉酸甲酯(MeJA)以及酵母提取物(YE)的强烈诱导。2.采用Gateway法成功构建了pEarleyGate100-SmERF1重组质粒,并且通过农杆菌介导法分别对丹参和烟草进行遗传转化,经筛选培养和DNA检测分别获得丹参和烟草阳性转化株系15个和5个。进一步分析其表达水平,获得高表达基因的丹参和烟草阳性转化株系8个和4个。在组织培养状态下,过表达SmERF1基因的烟草植株与野生型烟草相比出现了老叶泛黄、早花、生长缓慢等现象。3.对转基因丹参和烟草中ABA、GA含量及其合成途径中相关关键基因表达量进行检测,结果显示,与野生型相比,转基因丹参和烟草中ABA含量均明显升高,同时GA含量降低；ABA合成途径中的关键酶基因NtSDR和乙烯合成途径NtACS, NtACO等关键酶基因的表达在过表达株系中高于野生型株系；赤霉素合成途径关键酶基因GA20ox的表达明显下降。因此,我们推测,SmERF1基因可能通过调控ABA合成关键基因.NtSDR促进了ABA的生物合成。ABA含量的增加一方面可能抑制了GA20ox基因的表达减少了GA的合成,另一方面可能促进了乙烯合成关键基因ACS和ACO表达,可能促进乙烯合成。4.转SmERFl基因烟草种子变小,千粒重约是野生型的0.55～0.63倍；且转基因烟草种子萌发速度较野生型慢。结合ABA和GA含量分析结果,我们推测转基因烟草种子变小的表型可能源于ABA含量的增加；种子的萌发变慢,一方面可能受到种子大小的影响,另一方面也可能受到了ABA的抑制。5.用400mmol/LNaCl对转基因丹参和烟草进行盐胁迫处理,结果表明转基因株系抗盐胁迫能力明显高于野生型植株。处理7d后,转基因株系长势明显优于野生对照株系,其脯氨酸含量、SOD、POD活性较野生型高；MDA含量与野生型相比较低。我们推测SmERFl可能通过促进ABA的生物合成,增强了转基因丹参和烟草对高盐的耐受性。6.采用HPLC法检测丹参中主要有效成分的含量,结果显示,转基因株系1、16中隐丹参酮、丹参酮ⅡA含量较野生型有所提高,但提高幅度很小,而转基因株系11中四种次生代谢产物含量较野生型都有所减少。我们推测株系11可能是由于插入位置不同,导致其他丹参酮合成途径相关的基因表达下降所致。综上所述,SmERFl基因作为AP2/ERF转录因子家族成员,在植物种子大小决定、抵御盐胁迫中起着重要作用,而在丹参次生代谢调控中的作用不大。
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【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q943.2;S567.53

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