纳米氧化铝引起裸耐药基因转移至大肠杆菌K12及其机制研究

发布时间：2018-03-17 07:43

  本文选题：耐药基因　切入点：纳米氧化铝　出处：《山东师范大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：纳米材料的污染和耐药基因的扩散正日益成为全球公共健康的威胁。当纳米材料和耐药基因(antibiotic resistance genes,ARGs)相遇,它们会如何相互作用?纳米材料是否能够协助死亡菌体释放的耐药基因进入活的菌体细胞从而引起耐药基因的扩散?本项目采用抗性筛选法研究不同尺寸、不同浓度氧化物对不同浓度、不同种类耐药基因水平转移入不同菌株细胞的影响。结果表明纳米氧化物颗粒,特别是纳米氧化铝(nano-Al2O3)能够促进耐药基因的水平转移。与大肠杆菌K12相比,大肠杆菌HB101是一种易于耐药基因转化的菌株,能够摄入更多的耐药质粒,所以我们推断转化是纳米颗粒促进耐药基因水平转移的方式之一。同时,这种促转移作用与耐药质粒和纳米颗粒的结合有关,所以纳米颗粒可能载带耐药质粒进入菌体细胞,然后缓慢释放。本文证明纳米氧化铝能够显著促进质粒介导的耐药基因转化,包括进入革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(质粒需修饰),而尺寸大的氧化铝颗粒无此作用。在适宜条件下菌体细胞与纳米氧化铝相互作用,每100 ng耐药质粒能够获得7.4×106个大肠杆菌转化子,或者2.9×105个金黄色葡萄球菌转化子。纳米颗粒的浓度、质粒浓度、菌体细胞数目、材料与菌体细胞的作用时间、涡旋混匀时间等因素都会影响转化效率。我们进一步探讨了现象背后的机制。通过原位杂交和扫描电镜观察,结果表明纳米氧化铝可损伤细菌细胞膜,致其产生孔洞,耐药基因可通过孔洞进入细胞。活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)检测实验、转录组基因芯片分析和实时定量聚合酶链式反应结果表明内源性活性氧自由基可能损伤细胞膜,SOS(Save Our Ship,SOS)应答促进了耐药基因的转化。抗生素的滥用使环境中耐药基因和耐药菌大规模爆发,带来了人和动物的公共健康问题。我们的前期研究结果表明在我国主要河流中不仅能检测到天然的耐药基因,也发现了人工合成的耐药基因。研究表明:在水中纳米颗粒能够显著促进质粒RP4、RK2、p CF10介导的耐药基因接合转移。本研究证实纳米颗粒通过结合和致密压缩耐药基因从而保护其抵抗核酸酶Hind III、Hinc II、Sal I、Sty I、Nco I、Nde I和DNase I的降解,并作为载体参与耐药基因的转移。这种结合与纳米颗粒的浓度、两者作用时间、离子种类和浓度有关。基于红外光谱、紫外光谱和原子力显微镜分析,我们推测纳米氧化铝帮助耐药基因抗酶解的机制为:纳米颗粒导致的致密压缩改变了耐药基因分子的结构。在紧密结合在一起抗酶解的同时,氧化铝纳米颗粒能够载带耐药质粒进入菌体细胞。本研究首次发现纳米氧化铝颗粒的这种载带功能,我们称之为转导。基因芯片转录组分析和实时定量PCR探讨了其分子机制。在合适条件下菌体细胞与nano-Al2O3-p BR322复合物相互作用,每100 ng耐药质粒能够获得3.5×104个大肠杆菌转化子。与纳米氧化铝结合的耐药质粒越多,耐药基因的转移率就越高。转导作用的分子机制可能为:纳米氧化铝载带耐药质粒跨膜转运时,引起细胞应答反应,抑制关键的代谢基因rdg B、gly A、pgm、acc C、deo D、pgi、asp C等的表达,为细胞节省能量和物质。上调pol B、rec N、ruv A、uvr B、uvr D、din G等SOS应答基因,促进耐药基因的复制与表达。氧化物特别是氧化铝纳米颗粒能够通过转化和转导方式促进耐药基因的水平转移,其机制可能为氧化损伤。采用数学模型分析了不同方式在不同时间点的比重变化,结果表明随着纳米颗粒与细胞作用时间的延长,转化所占的比重越来越大。结论:纳米颗粒在适当条件下能够促进耐药基因的水平转移,但其机制有待进一步研究。我们的结果也暗示:环境中纳米材料可能在帮助细菌获得耐药性,其所带来的环境和健康风险应当引起人们的注意。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：TB383.1;R378

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本文编号：1623799