循环miRNA与晚期非小细胞肺癌患者EGFR基因突变状态及EGFR-TKI疗效的相关性研究

发布时间：2018-03-18 05:31

本文选题：微小RNA　切入点：EGFR　出处：《中国人民解放军军事医学科学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：前言肺癌的发病率与死亡率在全球范围内始终居于诸多恶性肿瘤的前位,严重威胁人类生命与健康[1]。虽然近年来肺癌领域有诸多进展,其整体5年生存率仍较低[2]。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)约占肺癌总数的80%~85%,主要分为腺癌、鳞癌及大细胞癌。绝大多数NSCLC患者确诊时已为中晚期,化疗、分子靶向治疗、放疗及免疫治疗等是其主要选择,这其中驱动基因指导下的个体化分子靶向“精准治疗”可谓引领了NSCLC治疗的新时代。NSCLC目前最主要的“可药化”驱动基因当属表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因,约占NSCLC总驱动基因的44%[3]。EGFR敏感突变在亚裔人群中阳性率约30%~40%,高加索人群中为10%~20%[4]。EGFR基因第19号外显子缺失突变(EGFR mutation of exon 19 deletions,EGFR 19DEL)以及第21号外显子L858R点突变(EGFR mutation of exon 21 L858R substitutions,EGFR L858R)是最主要的两种敏感突变类型,占到EGFR总突变类型的85%~90%[5]。目前各大指南推荐的EGFR基因突变检测系基于肿瘤组织或细胞学标本进行,被认定为“金标准”,然而在临床实践中,部分患者的肿瘤组织难以获取,并且二次活检进行EGFR基因突变的动态再分型较难实现。这使得基于血液以及体液等均质样本的“液态活检”成为热点。目前研究最为成熟的为血浆游离肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ct DNA)检测EGFR敏感突变的技术,然而,与金标准相比,ct DNA检测虽有较高的特异性(达95%~100%),但敏感性仅65%~75%左右[6]。改善提高现有技术的灵敏度或研发新的EGFR敏感突变检测技术,另外如有新的潜在诊断标志物与其联合,有望进一步提高其临床应用价值。微小RNA(micro RNA,miRNA)属非编码RNA,其表达失控可引起包括其调控的靶基因以及其相关的重要信号通路组成的调控网络发生异常,促进了肿瘤的发生或发展[7,8]。研究显示目前发现的人类miRNA分子中多数能够在人类体液中检出,部分指标在恶性肿瘤患者中有不同程度的表达失调[9]。由于在循环中的稳定性以及良好的敏感性与特异性,循环miRNA有望作为一种新的肿瘤标志物应用于多种恶性肿瘤的诊疗。目前亦有少数研究报道在EGFR敏感突变型及EGFR野生型患者的血液样本中检测到了有显著差异的miRNA,这些研究多为小样本的探索性研究,未能针对EGFR主要不同突变类型进行完整的对照分析,且各研究结果亦有较大的差别[10-12]。目前为止缺乏其他针对NSCLC患者血浆样本循环miRNA作为EGFR敏感突变状态潜在标志物的更为深入的研究。本研究首先从在本科室确诊的首诊NSCLC患者中随机选取部分病例,回顾性分析现实情况中收治NSCLC患者的EGFR基因突变检测状况,明确真实世界中能顺利完成EGFR基因突变检测并接受EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)一线治疗的患者比率;同时系统地收集不同临床特征人群的血浆样本,尝试寻找在EGFR敏感突变及EGFR野生型患者血浆中有差异表达的miRNA并首次探索性地分析了循环miRNA随EGFR-TKI治疗过程的动态变化;而且本研究建立起适合本研究的检测血浆miRNA的q RT-PCR的实验方法并筛选出适合的内参基因;这为后续扩大样本及进一步深入研究奠定了基础。第一部分:单中心首诊NSCLC患者EGFR基因突变检测情况回顾目的:总结了解现实情况中收治EGFR基因突变检测状况及突变检测结果。方法:回顾性分析2013年04月至2016年04月期间就诊于我科627例首诊的NSCLC患者的临床病理特征,重点分析其EGFR基因突变检测情况,对EGFR敏感突变的患者接受EGFR-TKI治疗的无进展生存期(progression-free survival,PFS)进行分析总结。结果:所有纳入NSCLC患者(n=627)的中位年龄为58岁,其中56.0%(315/627)为男性,48.6%(305/627)患者无吸烟史,82.6%(518/627)患者临床分期为IV期,84.4%(529/627)患者病理类型为腺癌。75.4%(473/627)的患者接受了EGFR基因突变检测,患者从就诊至取得病理诊断以及EGFR突变分型报告的中位诊断时间为12天(5-27天),送检样本类型以组织标本为主,占63.8%(302/473),其次为血浆样本,占23.0%(109/473),胸水样本占5.5%(26/473),其余36例患者同时送检了组织及血浆样本。血液样本送检的比例随年份的增加而呈升高趋势,2015年04月至2016年04月期间,送检的血液样本占40.7%。在接受检测的NSCLC患者中,EGFR敏感突变阳性率为35.7%(169/473),其中94例(55.6%)为EGFR 19DEL,69例(40.8%)为EGFR L858R,余6例为少见突变。EGFR MU(+)与EGFR WT组患者相比,其年龄、性别、吸烟史及病理类型分布均有显著差别。EGFR敏感突变的169例患者中有133例一线接受了EGFR-TKI治疗,客观缓解率(objective response rate,ORR)73.7%,中位PFS 10.0个月(95%CI 8.75-11.25)。其中EGFR 19DEL组患者中位PFS要优于EGFR L858R组患者(11.0个月vs 8.0个月,HR=0.57,p=0.011)。结论:我科临床实践工作中有较高比例的首诊NSCLC患者接受了EGFR分子分型检测。血液标本送检的比例呈逐年升高趋势。EGFR敏感突变的NSCLC患者一线接受EGFR-TKI有较好的疗效,且EGFR 19DEL患者PFS优于EGFR L858R患者。第二部分:EGFR敏感突变与EGFR野生型NSCLC患者血浆差异性表达miRNA的初步筛选目的:通过miRNA microarray芯片初步寻找出在EGFR敏感突变[EGFR MU(+)]及EGFR野生型(EGFR WT)患者血浆样本中有差异表达的miRNA。方法:收集9例NSCLC患者(3例EGFR 19DEL、3例EGFR L858R、3例EGFR WT)、4例健康受试者(healthy cohorts,HCs)血浆样本。运用Agilent Human miRNA Microarray(V21.0)芯片对样本进行独立的全基因组miRNA表达分析。采用Gene Spring GX软件进行数据归一化处理。采用T-test unpair方法计算得到p值以比较样本间miRNA差异表达;运用聚类分析方法(Hierarchical clustering)进行miRNA表达差异的分类。结果:所有NSCLC与HCs血浆样本中有76个呈显著性差异的miRNA。EGFR MU(+)与EGFR WT患者相比,有6个miRNA显著上调、4个显著下调。具体到EGFR敏感突变的不同类型,EGFR 19DEL较EGFR WT相比,有14个miRNA显著上调、7个显著下调;而EGFR L858R较EGFR WT相比仅有2个显著上调以及3个显著下调的miRNA;EGFR 19DEL与EGFR L858R相比有22个呈显著差异表达的miRNA。结论:通过miRNA microarray芯片检测,NSCLC与HCs人群之间以及不同EGFR敏感突变NSCLC患者之间可以在血浆样本中发现有显著差异的miRNA,可从中进行初步筛选并后续进行分析验证。第三部分:反转录实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法检测循环miRNA的内参筛选目的:筛选出最适合本实验体系的以q RT-PCR方法检测受试者循环miRNA的内参基因。方法:共收集34例不同人群受试者血浆样本:HCs 8例、肺良性疾病者8例、肺腺癌10例、肺鳞癌4例、肺小细胞癌4例。以q RT-PCR方法检测样本中12个备选内参基因的表达水平。以各样本中备选内参基因的原始Ct值与Ct均值的差值在EXCEL软件绘制散点图,观察各样本中待筛内参基因的稳定性;之后采用ge Norm、Norm Finder和Best Keeper软件对备选内参基因在不同样本中的表达稳定性进行分析。结果:散点图显示以5SrRNA、18SrRNA以及RNU43变异幅度最小。Best Keeper软件分析显示CP值最低的为5Sr RNA及18Sr RNA,分别为1.806及1.821;Norm Finder软件分析结果显示5Sr RNA的稳定性值(Stability value)为最低(0.303),其次为RNU43(0.631);ge Norm软件分析结果显示5Sr RNA和RNU38B的M值为最低(1.281),结合配对变异分析Vn/n+1结果图推荐5Sr RNA和RNU38B的组合作为内参基因。结论:实验确定在本体系中以5SrRNA作为qRT-PCR方法检测NSCLC患者循环miRNA表达水平的内参基因最为适宜。第四部分:EGFR MU(+)与EGFR WT的NSCLC患者血浆差异性表达miRNA的分析与验证目的:以q RT-PCR方法检测目的miRNA在扩大样本的各组患者血浆中的表达情况,筛选出可能与EGFR敏感突变相关的特异性循环miRNA。方法:结合芯片结果以及已发表文献,筛选出备选的目的差异miRNA。通过在20例NSCLC(12例EGFR 19DEL及8例EGFR WT)及8例HCs血浆样本中的预实验,初步筛选出有差异表达的miRNA后,对153例NSCLC患者(EGFR19DEL 64例,EGFR L858R 36例,EGFR WT 53例)进行扩大样本分析。不同组别之间miRNA的差异表达比较用非配对T检验或单因素方差分析进行分析。卡方检验用来分析定性资料。采用软件进行受试者工作特征曲线(Receiving Operating Characteristics Curve,ROC)及Logistic回归分析(Logistic Regression)评估目的miRNA区分不同EGFR基因突变类型的诊断价值。采用Target Scan、Pic Tar、miRDB以及miRanda软件对得到的目的miRNA进行靶基因预测并通过KEGG pathway预测其相关的信号通路。结果:预实验中对10个待筛的目的miRNA进行qRT-PCR检测,结果显示miR-107、miR-122、miR-125a-5p及miR-195可作为目的miRNA进行后续分析。扩大样本后分析结果显示,miR-107可较好的区分EGFR 19DEL与EGFR WT(AUC=0.72,敏感性64.7%,特异性76.6%,cutoff=0.097)以及EGFR L858R与EGFR WT(AUC=0.77,敏感性64.2%,特异性80.6%,cutoff=0.153);与EGFR WT组相比,miR-122诊断EGFR L858R的敏感性和特异性分别为73.6%及63.9%(cutoff=0.124),AUC=0.75;miR-195作为潜在标志物诊断EGFR 19DEL的敏感性和特异性分别为71.8%及69.1%(cutoff=0.876),AUC=0.75。miR-107分别与miR-122及miR-195组成的组合标志物其各诊断参数优于各自单个指标。多因素分析结果显示,吸烟状态以及miR-107的表达与EGFR敏感突变状态密切相关。miR-107可能通过靶向于CACNA2D1、NF1、BDNF基因而参与到MAPK信号通路;miR-195可能通过靶基因HMGA2及RECK而参与MAPK信号通路。结论:NSCLC患者血浆中循环miR-107、miR-122及miR-195的表达水平可能与EGFR19DEL或EGFR L858R突变亚型有显著相关性,有望作为潜在的标志物来辅助区分NSCLC患者EGFR敏感突变与野生型的基因分型。第五部分:目的循环miRNA在EGFR-TKI治疗前后动态变化的初步分析目的:初步探索EGFR 19DEL的NSCLC患者在接受EGFR-TKI治疗前、治疗过程中以及进展后的循环miRNA的动态变化。方法:收集36例EGFR 19DEL敏感突变并采集到EGFR-TKI治疗前与治疗中动态配对血样的患者血浆标本(其中有12例患者同时采集到疾病进展后的血样),对上述血样进行q RT-PCR方法检测其miR-107以及miR-195的表达情况。以EXCEL图表功能直观分析EGFR-TKI治疗前、治疗中以及进展后ΔCt值的动态变化。不同组别之间miRNA的ΔCt值变化情况比较用非配对t检验或单因素方差分析方法进行分析。结果:近期疗效为缓解(CR+PR)患者较疾病稳定(SD)患者相比,miR-107以及miR-195在治疗后有更为显著的下降趋势(p0.05);而PFS8.0个月以及PFS≤8.0个月的患者其两个目的miRNA的变化幅度未发现有显著性差异。无论是近期疗效是缓解、稳定还是进展的患者,其血浆miR-107以及miR-195在疾病进展后都有回到治疗前水平的趋势。结论:循环miRNA的表达水平会随EGFR-TKI治疗进程发生动态变化,且近期疗效不同的患者可能表现出不同的变化趋势。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R734.2

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