石磺进化相关基因的克隆及表达分析

发布时间：2018-03-19 06:30

  本文选题：石磺　切入点：表达分析　出处：《上海海洋大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：进化论观点认为生命起源于海洋,生物从水栖向陆栖进化,两栖类是进化过程中产生的过渡态物种。石磺科(Onchidiidae)贝类,隶属于软体动物门(Mollusca)、腹足纲(Gastropoda)、肺螺亚纲(Pulmonata)、缩眼目(Systellommatophora),其幼虫生活在水中,变态发育后具有明显的两栖性,被认为是无脊椎动物由浅海向陆地进化的过渡类群,具有重要的学术价值。我国华东地区分布着瘤背石磺(Onchidium struma)、平疣桑椹石磺(Platevindex mortoni)、里氏拟石磺(Paraoncidium reevesii)和紫色疣石磺(Peronia verruculata),生存环境由潮间带向潮上带迁移,产生出具有时空代表性的表型差异。本论文依据石磺转录组数据库,开发出四种石磺间表型进化相关基因,Os-NMHC,Os-RYR,Os-IP3R,Os-MEK,Os-IP3K的cDNA序列,通过RT-PCR技术探究基因的种间差异表达趋势,从基因表达水平探究石磺表型进化差异的同时,也初步地探究了NMHC基因亚型进化节点问题以及相似钙调蛋白RYR和IP3R基因的进化趋势。首次于石磺科贝类中克隆出一条差异表达的Ⅱ型非肌肉型肌球蛋白重链基因(NMHCⅡ)的cDNA全长,将其命名为Os-NMHC基因。其序列全长6057bp,包括5733bp的开放阅读框,236bp的5’端非翻译区,88bp的3’端非翻译区,共编码1910个氨基酸;预测蛋白质等电点为5.26,相对分子质量为220.46KD;通过Phyre2程序和Pymol软件构建蛋白质三级结构图,预测蛋白质二级结构以α螺旋和β折叠为主;通过Clustalx和dnaMAN软件进行氨基酸序列比对,发现其与爪蟾NMHC II A序列一致度为60.37%,与爪蟾NMHC II B序列相似度为61.47%;通过Bayes软件构建系统进化树,发现其与加州海兔亲缘关系最近。通过QRT-PCR技术检测,发现该基因在四种石磺的背部、腹部、腹足部、肺囊、心脏、神经节中均有不同程度的表达。种间表达水平与进化趋势相一致,依次为:瘤背石磺≥平疣桑椹石磺里氏拟石磺紫色疣石磺。对于石磺Os-NMHC基因的研究,将有助于NMHC亚型进化节点问题的探究,并为石磺科贝类由浅海向湿地进化的机制研究提供新视角。RYR和IP3R是两种结构相似、功能相近的钙调蛋白,通过RACE技术于瘤背石磺中开发出Os-RYR和Os-IP3R的cDNA3’末端保守区序列。Os-RYR核酸序列1253bp,包括83bp的3’非编码区,翻译氨基酸残基376个,与加州海兔RYR末端保守区序列一致度为94%。Os-IP3R核酸序列4574bp,包括1561bp的3’非编码区,翻译936个氨基酸残基,与加州海兔IP3R末端保守区序列一致度为85%。Clustal omega在线比对,Os-RYR和Os-IP3R钙离子通道在GXRXGGGXGD处的序列高度保守,证明该序列对于形成离子通道具有重要作用。Os-IP3R离子通道保守区与加州海兔IP3R离子通道保守区序列相似度为94%,蛋白质三级结构重合度极高。QRT-PCR分析结果显示,Os-RYR和Os-IP3R在紫色疣石磺中表达水平均最低,Os-RYR在石磺物种间的表达水平不具有梯度趋势,Os-IP3R在瘤背石磺、平疣桑椹石磺、紫色疣石磺中表达量呈梯度下降趋势。Os-IP3R/Os-RYR表达百分比在紫色疣石磺、平疣桑椹石磺、瘤背石磺中呈梯度上升趋势,说明功能相同结构相似的两种钙调蛋白基因Os-IP3R和Os-RYR,在石磺由浅海向湿地进化过程中,对Os-IP3R的钙调功能呈现增加的趋势,其表达具有一定得趋向性。以高等动物VEGF信号通路分子为基础,结合石磺转录组数据库,认为石磺中VEGF信号通路(血管内皮生长因子信号通路)中不存在IP3K/AKT和mTOR通路途径,并筛选出与钙调蛋白Os-IP3R具有互作关系的Os-IP3K通路分子以及表皮生长相关的下游通路分子Os-MEK。克隆瘤背石磺Os-MEK核酸序列全长1201bp,包括40bp 5’的非编码区和83bp的3’非编码区,共编码368个氨基酸残基,与加州海兔MEK基因编码氨基酸序列一致度达到82%。Os-MEK蛋白质三级结构包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和少量无规卷曲结构。克隆Os-IP3K核酸序列全长3661bp,不包括3’和5’端非编码区,编码721个氨基酸残基。RT-PCR分析结果显示Os-IP3K在瘤背石磺各组织中的表达趋势与Os-IP3R表达趋势一致。在平疣桑椹石磺神经节中不表达Os-IP3R,但是Os-IP3K的表达水平却是各组织中最高的。提示功能相关的通路分子Os-IP3R和Os-IP3K在石磺科不同物种间的互作功能有所不同,对于石磺科贝类信号通路分子的开发和表达分析以及通路进化研究具有重要意义。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

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本文编号：1633208