携带hTERT-P2A-EGFP基因真核表达质粒的构建和鉴定

发布时间：2018-03-21 00:27

  本文选题：人端粒酶逆转录酶　切入点：绿色荧光蛋白　出处：《吉林大学学报(医学版)》2017年02期 　论文类型：期刊论文

【摘要】：目的:构建真核表达质粒hTERT-P2A-EGFP,探讨其在HEK293FT细胞中的表达和转染效率。方法:利用pBABE-puro-hTERT和pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP质粒构建重组质粒。以该质粒为模板采用PCR法获取hTERT、P2A和EGFP基因,采用重叠PCR法获得目的片段hTERT-P2A-EGFP,经酶切后目的片段与真核表达载体pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP连接,得到并鉴定含有hTERT-P2A-EGFP基因的重组质粒。经脂质体介导重组质粒转染到HEK293FT细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)在细胞中的表达。结果:PCR检测目的基因hTERT、P2A和EGFP的片段长度分别为3 400、110和720bp。酶切后目的基因片段hTERT-P2A-EGFP约4 300bp。测序分析,目的基因1 547位点发生了突变。利用定点突变技术成功诱变,再次测序后目的基因序列与GenBank公布的基因序列完全一致。重组质粒转染HEK293FT细胞后在荧光显微镜下可以观察到GFP。流式细胞术检测,重组质粒转染HEK293FT细胞的效率为44.8%。结论:成功构建携带目的基因hTERT-P2A-EGFP的重组质粒,且可用于细胞转染。
[Abstract]:Aim: to construct the eukaryotic expression plasmid hTERT-P2A-EGFP, and to investigate its expression and transfection efficiency in HEK293FT cells. Methods: the recombinant plasmid was constructed by using pBABE-puro-hTERT and pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP plasmids. HTERT-P2A and EGFP genes were obtained by PCR using the plasmid as template. The target fragment hTERT-P2A-EGFP was obtained by overlapping PCR method and ligated with eukaryotic expression vector pRRLSIN-cPPT-MSCV-EGFP. The recombinant plasmid containing hTERT-P2A-EGFP gene was obtained and identified. The recombinant plasmid was transfected into HEK293FT cells by liposome-mediated recombinant plasmid. Results the length of the target gene hTERT P2A and EGFP were 3 400,110 and 720 bp. the target gene hTERT-P2A-EGFP was about 4 300 BP. Objective Gene mutation occurred at 1 547 locus. Site-directed mutagenesis was successfully used. After re-sequencing, the sequence of the target gene was identical to that published by GenBank. After transfection of the recombinant plasmid into HEK293FT cells, GFP-flow cytometry was observed under fluorescence microscope. Conclusion: the recombinant plasmid carrying the target gene hTERT-P2A-EGFP can be successfully constructed and can be used for cell transfection.
【作者单位】： 吉林大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室;吉林大学第一医院转化医学研究院;吉林大学免疫学研究所;
【基金】：国家自然科学基金资助课题(81202379)
【分类号】：Q78

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本文编号：1641463