GSTM3基因的表达及表观遗传学改变与年龄相关性白内障的关系
本文选题：谷胱甘肽S-转移酶M3 切入点：年龄相关性白内障 出处：《南通大学》2016年硕士论文
【摘要】：目的探索DNA氧化损伤清除基因谷胱甘肽S-转移酶M3(glutathione S-transferase Mu 3,GSTM3)在年龄相关性白内障(age-related cataract,ARC)患者晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)和晶状体皮质中的表达及甲基化状态与组蛋白修饰的改变,并分析其表达变化与表观遗传修饰的关系。方法采用临床病例对照研究和细胞生物学研究。病例组为2014年9月-2015年9月在南通大学附属医院眼科诊断为ARC,LOCSⅢ分级晶状体混浊程度≥C4,并接受白内障手术的患者,共120例120眼;对照组为本院眼科诊断为玻璃体视网膜疾病(如特发性黄斑前膜、特发性黄斑裂孔等),且同时在玻璃体切除手术中行透明晶状体摘除者,以及来源于南通市红十字眼库新鲜眼球中的透明晶状体,年龄、性别匹配,共40例40眼。于手术中取得晶状体前囊膜及皮质,提取DNA、RNA和蛋白质。实时荧光定量聚合酶链式反应(quantificational real-time polymerase chain reaction,q RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western Blot)分析GSTM3 m RNA和蛋白质表达水平,甲基化特异性PCR法(bisulfite-sequencing PCR,BSP)及焦磷酸测序法(pyrosequencing)检测GSTM3 DNA甲基化状态。用不同浓度过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)处理人晶状体上皮细胞株SRA01/04和HLEB3,构建氧化损伤模型,检测SRA01/04和HLEB3中GSTM3的表达量变化及甲基化状态,染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)分析GSTM3组蛋白甲基化和乙酰化修饰状态,对HLEB3分别进行5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC)去甲基化处理和曲古霉素(trichostatin A,TSA)抑制组蛋白去乙酰化酶处理后检测GSTM3蛋白质表达量变化。凝胶电泳迁移率实验(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测GSTM3启动子区与转录因子的结合能力。SPSS17.0统计软件分析数据。结果晶状体组织q RT-PCR及Western Blot结果表明,与对照组相比,三种类型ARC患者晶状体LECs及皮质中GSTM3表达量均下降(m RNA:F=308.90,P0.01;F=198.42,P0.01;蛋白质:F=219.74,P0.01;F=195.77,P0.01)。BSP分析及焦磷酸测序表明在ARC患者晶状体LECs及皮质中GSTM3启动子区Cp G岛呈现高甲基化(晶状体LECs对照组:2.00±1.36,ARC-C:20.11±1.23,ARC-N:25.17±1.18,ARC-P:17.94±1.51,F=1138.44,P0.01;晶状体皮质对照组:4.72±1.49,ARC-C:19.80±1.26,ARC-N:26.75±1.02,ARC-P:20.03±1.36,F=1035.63,P0.01)。细胞生物学实验结果表明:与SRA01/04相比,HLEB3中GSTM3表达量下降(t=14.48,P0.01;t=16.32,P0.01),相应地,HLEB3中GSTM3启动子区Cp G岛呈现高甲基化(SRA01/04:1.25±0.67,HLEB3:20.58±1.07,t=26.51,P0.01)。与SRA01/04相比,HLEB3的H3K9三甲基化增高而H3乙酰化下降(t=19.21,P0.01;t=6.16,P0.01)。对HLEB3进行5-Aza-d C或TSA处理后,GSTM3蛋白质表达量升高(t=7.24,P0.01;t=10.94,P0.01)。EMSA提示GSTM3启动子区高甲基化阻碍转录因子结合。在人晶状体上皮细胞株氧化损伤模型中GSTM3表达水平降低(m RNA:F=54.43,P0.01;F=66.82,P0.01;蛋白质:F=7.44,P0.01;F=30.62,P0.01),GSTM3启动子区Cp G岛甲基化水平升高(F=989.04,P0.01;F=595.94,P0.01)。结论GSTM3表达的下降可能与ARC的发生发展相关。GSTM3启动子区Cp G岛的DNA甲基化及组蛋白修饰可能调节其表达。结果提示调节表观遗传学的变化可作为ARC防治的新靶点。
[Abstract]:Objective to explore the oxidative damage of DNA scavenging gene glutathione S- transferase M3 (glutathione S-transferase Mu 3, GSTM3) in age-related cataract (age-related cataract, ARC) in lens epithelial cells (lens epithelial cells, with LECs) and lens cortex expression and methylation and histone modification changes, and to analyze its expression the change and the relationship between apparent genetic modification. Method of control research and cell biology by clinical cases. The case group for the September 2014 -2015 year in September in Hospital Affiliated to Nantong University diagnosed ARC, LOCS grade III lens opacity is larger than C4, and patients undergoing cataract surgery, 120 eyes of 120 cases; the control group for the hospital diagnosis vitreous body and retinal diseases (such as idiopathic epiretinal membrane, idiopathic macular hole etc.), and at the same time in the vitreous body resection in clear lens extraction, to Transparent lens, and from the Nantong City Red Cross yanku fresh eyeballs in age, gender, and a total of 40 eyes of 40 cases. In the operation in anterior lens capsule and cortex, extraction of DNA, RNA and protein. Real time fluorescence quantitative polymerase chain reaction (quantificational real-time polymerase chain reaction, Q RT-PCR) and Western blot (Western Blot GSTM3 m RNA) analysis and protein expression, methylation specific PCR (bisulfite-sequencing PCR BSP) and pyrosequencing (pyrosequencing) detection of GSTM3 DNA methylation state. With different concentrations of hydrogen peroxide (hydrogen peroxide, H2O2) SRA01/04 and HLEB3 human lens epithelial cells, establish the oxidative damage model that expression and methylation status of GSTM3 SRA01/04 and HLEB3, chromatin immunoprecipitation (chromatin immunoprecipitation, Ch IP) of GSTM3 group Histone methylation and acetylation status of HLEB3 were 5- aza -2'- deoxycytidine (5-Aza-2'-deoxycytidine, 5-Aza-dC) demethylation treatment and trichostatin (trichostatin A, TSA) histone deacetylase inhibition after treatment to detect GSTM3 protein expression change. Electrophoretic mobility shift assay (electrophoretic mobility shift assay, EMSA). The data analysis ability of.SPSS17.0 statistical software combined with detection of GSTM3 promoter region and transcription factor Q RT-PCR and Western the lens tissue Blot results showed that compared with the control group, three patients with type ARC lens LECs and cortical GSTM3 expression decreased (m RNA:F=308.90, P0.01; F=198.42, P0.01; protein: F=219.74, P0.01; F=195.77, P0.01).BSP analysis and pyrosequencing showed that patients with ARC and LECs in the lens cortex in the promoter region of the GSTM3 Cp island of G showed hypermethylation (lens LE Cs control group: 2 + 1.36, ARC-C:20.11 + 1.23, ARC-N:25.17 + 1.18, ARC-P:17.94 + 1.51, F=1138.44, P0.01; the lens cortex of control group: 4.72 + 1.49, ARC-C:19.80 + 1.26, ARC-N:26.75 + 1.02, ARC-P:20.03 + 1.36, F=1035.63, P0.01). Cell biology experiment results show that compared with SRA01/04, GSTM3 expression decreased HLEB3 (t=14.48, P0.01; t=16.32, P0.01), corresponding to HLEB3 in the promoter region of the GSTM3 Cp island of G showed high methylation (SRA01/04:1.25 + 0.67, HLEB3:20.58 + 1.07, t=26.51, P0.01). Compared with SRA01/04, H3K9 trimethyl HLEB3 of increased H3 acetylation decreased (t=19.21, P0.01; t=6.16 P0.01, 5-Aza-d C or TSA). After the treatment of HLEB3, GSTM3 protein expression increased (t=7.24, P0.01; t=10.94, P0.01).EMSA showed that the GSTM3 promoter hypermethylation hindering transcription factor binding in human lens epithelial cells. The expression of GSTM3 in the water oxidative damage model Ping (m RNA:F=54.43, P0.01 decreased; F=66.82, P0.01; F=7.44, P0.01; protein: F=30.62, P0.01, GSTM3) level of Cp promoter G island methylation of promoter region increased (F=989.04, P0.01; F=595.94, P0.01). The occurrence of DNA methylation and histone modifications related to the development of.GSTM3 Cp in the promoter region G island may decline conclusion ARC and GSTM3 expression may regulate its expression. It suggests that the adjustment of apparent change of genetics can become a new target for the prevention and treatment of ARC.
【学位授予单位】：南通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R776.1
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，本文编号：1664784
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